无偿献血人群HBV-DNA混样反应性孔位拆分2次结果分析

王 欢，陈 雪，赵 欣，季茂胜，张蓝江，董玉芳，魏彩冰，李 文

成都市血液中心血液筛查实验室，四川成都610041

自2010年我国实行献血者标本核酸检测试点工作以来，输血安全问题在很大程度上得到了改善[1]。核酸检测能缩短检测窗口期，降低经输血传播疾病的发病率[2-3]。2015年血站实行核酸检测全覆盖，我国所有血站的血液标本均需进行核酸检测，更大程度保障了输血安全[4]。

目前，血站核酸检测原理主要基于转录介导的扩增(TMA)和实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)两种方法[5]。后者的检测模式是先将标本进行混样检测，结果为非反应性的孔位中所含标本视为检测合格；结果为反应性的孔位进行拆分，拆分结果为反应性的标本被判定为核酸检测不合格。

本中心自2010年参加血站核酸检测试点工作以来，对COBAS s 201核酸系统混样检测呈反应性的孔位，在按照既定程序进行拆分的同时，均加做一次拆分，以达到双孔复试的目的。上述拆分模式在全国范围内少见。2次拆分的结果可能出现2次均未拆出、2次均拆出、仅第1次拆出、仅第2次拆出，以及同一孔位拆出不止1例反应性标本等几种情况。本研究统计近6年来该核酸系统的检测结果，回顾性分析2次拆分结果，分析混样和拆分CT值的相关性，并探讨对反应性孔位进行2次拆分的必要性。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2015—2020年COBAS s 201核酸系统上混样检测呈反应性的725 孔位及拆分出的543例乙型肝炎病毒(HBV)-DNA反应性标本作为研究对象。献血者中男365例，女100例；年龄18～60岁，平均(46.61±8.50)岁。所有标本均来自经体检合格的无偿献血者。

1.2仪器与试剂 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测采用全自动酶联免疫分析系统(Microlab FAME，瑞士Hamilton公司)，血型检测采用全自动加样仪(深圳市爱康生物科技股份有限公司)，转氨酶检测采用全自动生化分析仪(日本奥林巴斯公司)。转氨酶试剂(美国贝克曼库尔特公司)，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)试剂(意大利索灵诊断和上海科华生物工程股份有限公司)，抗-丙型肝炎病毒(HCV)(美国奥森多医疗和上海科华生物工程股份有限公司)，抗-人类免疫缺陷病毒(HIV)1/2(美国伯乐公司和北京万泰生物药业股份有限公司)，抗-梅毒螺旋体(TP)(北京华大吉比爱生物技术有限公司和北京万泰生物药业股份有限公司)。核酸检测为罗氏COBAS s 201核酸检测系统及配套试剂盒。

1.3方法 标本采集前，对献血者进行乙型肝炎表面抗原(胶体金法)和转氨酶初筛检测。体检和初筛检测结果合格的献血者再进行采血并留样。2管留样标本，1管是乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝的真空采血管(科华)，用于ELISA、转氨酶和血型检测。1管是无DNA酶，RNA酶带分离胶的EDTA-K2抗凝的BD试管，用于核酸检测。标本处理方法符合国家要求。

在完成转氨酶、血型和ELISA检测后，筛选合格标本进行核酸检测。对所有在COBAS s 201系统混样(6混1)检测呈反应性孔位，均采取2次拆分的检测模式。第1次拆分选用系统上“load secondary”的加样模式，仪器根据混样结果识别样本条码，自动进行拆分加样。第2次拆分选择“pool of 1”的加样模式。系统不能识别重复条码，在第2次拆分录入条码时，采取“原条码”+“=”的输入方式。

1.4统计学处理 采用Excel 2017处理数据及绘制图表。用SPSS23.0数据分析软件进行数据处理及统计分析。计数资料采用频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.12015—2020年混样反应性孔位 2次拆分结果 对725孔混样反应性孔位进行2次拆分，共有543例HBV-DNA反应性标本，拆出反应性率为74.90%。拆分结果见表1。340孔(46.90%)在2次拆分中均拆出同一HBV-DNA反应性标本；210孔(28.90%)2次拆分结果均为非反应性；108孔(14.90%)只在第1次拆分出1例HBV-DNA反应性标本；41孔(5.67%)仅第2次拆分出1例HBV-DNA反应性标本。26 孔(3.59%)拆出2例以上反应性标本，其中19 孔(CT值35.2～44.6)在2次拆分均有相同反应性标本拆出(表2中第1～4类)，7孔(CT值36.7～39.6)虽然拆出不止1例反应性标本，但2次拆分的结果不相同(表2第5～6类)，见表2。

表1 2015—2020年混样反应性孔位 2次拆分结果[n(%)]

表2 拆出2例及以上反应性标本的孔位拆分结果(n)

2.2混样结果与拆分CT值之间的关系 混样CT值<35的30孔，拆出反应性率为100.00%。且除1孔仅第1次拆分呈反应性结果外，其余29 孔均是2次拆分为同一反应性。见表3。当混样CT值<40时，两次拆分均为同一反应性标本的比例随着混样CT值降低而增加；当混样CT值<45时，两次拆分均为非反应性的比例随着混样CT值降低而降低；混样CT值与拆分结果之间关系的线性趋势见图1。

图1 混样CT值与拆分结果关系图

表3 混样CT值与拆分结果[n(%)]

2.3混样CT值与拆分CT值的相关性分析 分析4种不同拆分结果对应的混样CT值(拆出2例及以上反应性标本的26孔因数据少不纳入统计分析)，2次拆分为同一反应性、2次拆分均呈非反应性、仅第1次拆分呈反应性、仅第2次拆分呈反应性标本的CT值分别是(37.82±3.38)、(39.55±3.60)、(38.73±3.46)、(38.44±2.14)。混样CT值与拆分CT值呈正相关(r=0.243，P<0.05)。见表4。

表4 混样与拆分CT值统计分析

3 讨 论

本中心核酸检测实验室从建立至今，对在COBAS s 201核酸系统上混样检测呈反应性的孔位均进行2次拆分，以达到双孔复试的目的，为保障输血安全投入了大量的财力和人力。其中，2016年混样反应性孔位数量明显少于其他年份，是因当年在该系统上进行核酸检测的标本总量较少所致。

2015—2020年该系统725孔反应性孔位进行2次拆分后，共拆分出543例HBV-DNA反应性标本，拆出反应性率为74.90%，高于深圳、无锡和东莞地区(拆出反应性率分别是66.7%、66.67%、61.25%)[6-8]。本研究共有41例HBV-DNA反应性标本来自第2次拆分，拆分CT值最大47.30，最小35.21。姚凤兰等[9]对63例隐匿性HBV感染标本的感染状态分析发现，49例(77.78%)标本HBV-DNA水平低于20 IU/mL。陈少彬等[10]研究发现，在单检模式下，HBV水平为20 IU/mL时的漏检率为7.55%，低于混样模式下的漏检率81.4%(P<0.05)。低病毒拷贝标本在进行混样检测时，漏检的概率较单检更高。根据泊松分布原则，低病毒拷贝标本在取样时，可能会由于病毒颗粒分布不均导致病毒检测呈非反应性。因此，对于低病毒拷贝标本，2次拆分可以增加反应性标本的检出率，减少经输血传播疾病的发生，更保障了输血安全。

有研究指出，CT值大小与标本中病毒的原始拷贝数呈线性反比关系[11]。但当标本中病毒拷贝数低或者接近检测下限时，定性检测的混检与拆分CT值相关性较差，定性检测的CT值分析难以得出准确的趋势关系[8]。本研究中，混样CT值较高(>40)时，出现混样与拆分结果线性关系不强的情况，可能与上述原因有关。

拆出2例及以上反应性标本的26孔中，19孔(CT值35.2～44.6)在2次拆分均有相同反应性标本拆出，说明在上述孔位中，可能同时存在2例病毒拷贝数较高的标本，才能在2次拆分中均呈反应性结果；7孔(CT值36.7～39.6)2次拆分的反应性标本不相同，可能原因是标本仅含有低拷贝数HBV-DNA，根据泊松分布原则，存在病毒分布不均匀的情况，导致2次拆分结果不一致，此外，也存在假阳性的可能[11]。

除同时拆出2例及以上的26孔(未纳入分析)，其余4种拆分结果的混样CT值与拆分CT值呈正相关(r=0.243，P<0.05)，即混样CT值越小，拆分出的反应性标本CT值越小；混样CT值越大，拆分出的反应性标本CT值越大，当2次拆分均呈非反应性时，混样CT值最大。从理论上来讲，每经过3.3个热循环靶模板总量增加一个数量级[12]。混样CT值<35的30孔，拆出反应性率是100.0%，且除1孔外，其余全是2次拆分均呈反应性。只有第1次拆分呈反应性的108孔(1例除外)和只有第2次拆分呈反应性的41孔，混样CT值均≥35。因此，笔者认为混样CT值为35是一个关键点。在COBAS s 201核酸系统检测献血者标本时，若混样CT值<35且首次拆分结果呈非反应性，需重点关注，最好进行复查，避免标本漏检或者假阴性情况的出现，从而导致输血感染等严重后果。

同时，核酸检测假阳性结果也值得注意。采用标准化的程序检测献血者标本，规范工作人员的操作，保持仪器设备良好的运行状态，加强实验室的环境监控等措施能有效减少假阳性结果的出现。另外，本研究缺少反应性标本的确认结果，在未来应对可疑标本进行追踪，确认其真实的感染状态，从而保障血液安全，减少血液浪费。