一株猪链球菌的分离鉴定

赵应龙，马真明，张晓梅，于青越，吴俊达，王国君，张以芳，柴俊

(1.永平县杉阳镇农业综合服务中心畜牧兽医组，云南 永平 672607；2.寻甸县塘子街道办事处农业综合服务中心畜牧科，云南 寻甸 655203； 3.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201)

猪链球菌病(Swine Streptococcosis)是由多种致病性链球菌所致的猪不同临床类型多种疾病的总称[1]。导致该病的链球菌主要包括猪链球菌、马链球菌中的类马亚种和兽疫亚种以及兰氏分群中的D、E、L群链球菌[2]。所有致病性链球菌中猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2)致病力最强，分离和检出率也最高[3]。临床上，猪只感染猪链球菌2型后的症状主要包括出血性败血症、脑膜炎、关节炎、心包炎、化脓性淋巴结炎等[4]。链球菌本为革兰氏阳性菌，但在长期放置的培养基、陈旧的脓液标本中可表现为革兰氏阴性[5]，该种改变对病原的诊断会造成一定的影响。猪链球菌病属我国二类动物疫病，可感染各年龄阶段的猪，对人体也有一定的危害，属人兽共患病[6]。

猪只对链球菌的抵抗力最差，且链球菌病的发生不随地域区别和品种差异而有所区别[7]。猪链球菌病急性型表现为体温升高至40～41.5℃，呈稽留热，患病猪只脖颈、耳廓、下腹部及四肢末端的皮肤有出血斑点并呈现暗红色，天然孔道有不易凝固的暗红色血液流出[8]。急性病变均可转化为慢性病变，患病猪只全身关节多有浆液纤维素性炎症，从而导致猪只行走时疼痛、跛行、喜卧、难以站立等。患病较为严重的猪只甚至出现后肢瘫痪、麻痹，最终死亡[9]。此外，该病可感染特定人群，如生猪饲养员、兽医、屠宰人员等并导致死亡[10]。该病不仅对世界养猪业的发展造成严重威胁，也会危害人类的健康，应引起人们的高度关注。

1 材料与方法

1.1 样品来源

大理州某猪场送检的具有败血症、心包炎、关节炎等症状的病猪肝脏、脾脏组织及关节液样品。

1.2 主要试剂

营养肉汤、血琼脂培养基按常规方法配置；革兰氏染色剂、细菌DNA提取试剂盒、凝胶DNA回收试剂盒、2×Taq Super Mix、Nuclease-free Water、DL-5000 marker、琼脂糖均购自北京全式金生物技术股份有限公司。参考链球菌16S rRNA序列设计检测引物一对，引物序列如下，16S-F：5′-AGAGGTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S-R：5′-GGTTAGCTTGTTACGACTT-3′，预期扩增出1 130bp的目的条带，引物由擎科生物公司合成。

1.3 细菌的分离纯化及镜检

首先在无菌环境下将病猪的肝脏、脾脏组织样品剪碎同关节液样品一起放入营养肉汤培养基中，于37℃恒温振荡器中过夜培养扩菌，然后将菌液用平板划线法接种于血琼脂培养基上，于37℃恒温培养18～24h，观察菌落形态，挑取单个可疑菌落进行纯培养及革兰氏染色镜检。

1.4 细菌的PCR扩增、测序及分子鉴定

按细菌基因组RNA试剂盒说明书，对分离纯化培养的菌液进行基因组RNA提取，提取的RNA进行16S rRNA扩增。PCR反应总体系25μL：2×Taq Super Mix 12.5μL、上下游引物各1μL、RNA模板1μL、Nuclease-free Water 9.5μL，瞬时离心；PCR反应条件为：94℃ 10min，94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 2min，30个循环，72℃ 10min；PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样品胶回收送擎科生物科技有限公司进行测序，测序结果在GenBank数据库中进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养及镜检结果

经营养肉汤培养基扩增的菌液划线于血琼脂培养基上，37℃恒温培养24h后可见直径约1mm、表面稍凸、光滑潮湿、边缘整齐、呈灰白色半透明状的圆形菌落，且在菌落周围形成1～2mm宽的完全透明的溶血环，即典型的β型溶血(图1)。

图1 分离菌株在血琼脂培养基上的菌落形态

从血琼脂培养基上挑取单个可疑菌落进行革兰氏染色镜检，可观察到有成对或3～5个排列的蓝紫色短链状、大小均一的革兰氏阳性球菌(图2)。

图2 分离菌株的革兰氏染色镜检结果

2.2 分离菌株PCR鉴定结果

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见目的条带约为1 130 bp，与预期条带相符，大小与阳性对照片段相同(图3)。测序结果在GenBank数据库中进行比对分析后与猪链球菌2型的同源性为99.9%。

3 讨论

猪链球菌的血清型较多，其中1、2、7、9型较为常见，2型是最常见的一种[11]。该病原可通过破损的皮肤和黏膜伤口进入机体的血液和淋巴循环从而造成严重的炎症反应，导致较高的发病率和死亡率[12]。有研究结果显示，猪链球菌对常用的四环素类药物和大环内酯类药物有较高的耐药性[13]，且存在多重耐药性和耐药基因遗传的情况[14]。因此，快速进行疾病的病原诊断以及药敏试验筛选出敏感药物才能有效控制疾病。此外，要控制本病不仅需要根据当地流行菌株敏感药物以及有效多价疫苗的筛选来制定合理的免疫程序，按时进行免疫接种，还需要加强饲养管理，改善饲养环境，对病死猪进行无害化处理，定期对栏舍进行消毒，积极治疗才能最大程度地减少养殖户的损失。