再造烟叶生产过程物料微生物群落结构分析

张 登，杨春雪，马 慧，廖祥儒，管政兵*

1.上海烟草集团太仓海烟烟草薄片有限公司，江苏省太仓市东方东路19号 215433 2.江南大学生物工程学院，江苏省无锡市蠡湖大道1800号 214122

目前生产再造烟叶的工艺主要包括造纸法、辊压法和稠浆法，其中造纸法产品不仅可改善烟叶产品结构强度和燃烧性能，降低卷烟烟气烟碱和焦油量，同时还能降低烟叶单耗从而节约生产成本，因此应用最为广泛［1-2］。造纸法制再造烟叶首先要对烟梗、片烟末进行萃取，使可溶性物质和纤维物质分离，再将萃取后的烟梗、片烟末打浆处理，抄造成型，然后将可溶性物质浓缩加料后喷洒于基片上，最后烘干、分切涂布后的基片制成再造烟叶［3］。研究表明，造纸法再造烟叶生产线上微生物种类繁多，其中一些功能性微生物在再造烟叶生产过程中会产生酯类、醇类、萜类、酸类、酚类等香味物质［4-5］，且部分微生物还能降低有害物前体物质的含量［6］，另一些微生物的异常增殖会造成造纸法再造烟叶生产环节出现腐败、霉变等现象［7］。

高通量测序技术，也称第二代测序技术，虽已较广泛应用于烟草微生物多样性的分析，但应用该技术分析再造烟叶生产过程中微生物多样性的研究还较少。目前已报道的研究包括舒明等［8］对再造烟叶生产过程中的萃取液、浓缩液、醇化液进行细菌群落多样性高通量测序分析，显示占主导地位的细菌种群是厚壁菌门，而厚壁菌门中的优势菌属是乳杆菌属（Lactobacillus）和赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）；王充等［9］采用高通量测序技术对再造烟叶浓缩液进行了真菌和细菌群落结构分析，显示真菌种群中优势菌属为酿酒酵母属（Kazachstania）、假丝酵母属（Candida）和Ogataea，细菌种群优势菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）、链球菌属（Streptococcus）和Aeribacillus。为进一步了解再造烟叶生产过程微生物的多样性及其分布与变化情况，通过高通量测序法对造纸法再造烟叶不同生产阶段物料的细菌和真菌群落结构进行组成和丰度分析，探讨细菌和真菌在生产过程物料中的分布及变化情况，旨在为再造烟叶生产中有益微生物资源的挖掘和有害微生物的管控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

再造烟叶生产线各物料样品取自上海烟草集团太仓海烟烟草薄片有限公司，样品编号和名称如图1所示，分别为：BP_1片烟末，BP_2烟梗，BP_3预萃后烟梗，BP_4萃取后挤干物料，BP_5一级挤干后萃取液，BP_6离心后萃取液，BP_7浓缩液，BP_8新鲜涂布液，BP_9抄前浆料，BP_10净化后白水，BP_11白水，BP_12一级浆料（挤干后烟梗和片烟末一级破碎），BP_13二级浆料（挤干后烟梗和片烟末二级破碎），BP_14损纸浆，BP_15冲浆白水（用于稀释抄前浆的浓白水），BP_16基片，BP_17涂布液（放置2 h的涂布液），BP_18烘箱后再造烟叶，BP_19分切后再造烟叶，BP_20打包再造烟叶，BP_21木浆，BP_22木浆板（用于破碎成木浆），BP_23上毛毯积浆，BP_24再造烟叶成品（2016年），BP_25再造烟叶成品（2015年）。重复3次取样，样品采集后用无菌塑封袋或塑料瓶密封，液体样品进行离心后收集菌体沉淀，冰袋冷藏送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序分析。

图1 样品来源分布流程图Fig.1 Flow chart of sample sources and their distributions

1.2 基因组DNA的提取

采用基因组DNA提取试剂盒TruSeqTMDNA Sample Prep Kit（美国Illumina公司）制备样品微生物基因组总DNA，提取结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量，DNA样品置于-20℃冰箱保存。

1.3 PCR扩增及高通量测序

扩增细菌16S rRNA基因的引物为515F与907R，用于扩增基因的V3-V4区；扩增真菌rRNA基因间隔区序列（ITS序列）的引物为ITS1F和ITS2R，用于扩增ITS1区。PCR扩增使用TransStart®Fastpfu DNA Polymerase试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），所有样品的PCR扩增重复3次，将同一样品的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）切胶回收PCR产物。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluoTM-ST蓝色荧光定量系统［普洛麦格（北京）生物技术有限公司］进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例混合，最后在Illumina MiSeq测序平台（美国Illumina公司）对PCR产物序列进行双端测序。基因组DNA提取、文库构建与测序均在上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.4 数据分析

原始的测序序列由Flash（version 1.2.11）软件进行双端序列拼接，处理后的序列用QIIME（version 1.9.1）软件在97%的相似水平下对优化序列进行OTU划分。对OTU序列进行物种注释，进而生成各分类学水平微生物丰度表。通过Mothur（version 1.30.2）α多样性分析单个样品的微生物物种多样性，通过β多样性比较不同样品间细菌和真菌的群落组成和结构差异，并分别利用香农（Shannon）指数、Chao指数、物种丰富度指数（ACE）、有效数据覆盖率（Goods coverage）指数和逆辛普森（Inverse Simpson）指数公式计算微生物多样性指数。

2 结果与分析

2.1 再造烟叶生产过程细菌群落多样性分析

2.1.1 测序数据统计

提取再造烟叶生产过程中25个不同生产阶段物料样品的微生物基因组DNA，对细菌16S rRNA基因V3-V4区PCR扩增测序后，经过滤和双端拼接，结果显示除样品BP_22木浆板、BP_24再造烟叶成品（2016年）、BP_25再造烟叶成品（2015年）未获得测序结果外，其余22个样品共获得了1 083 987条有效序列，平均长度为376 bp，得到644个OTU。使用Greengenes细菌分类学数据库对每个OTU代表序列进行物种注释，共注释得到21个门、43个纲、116个目、209个科、393个属和543个种水平的细菌微生物。

2.1.2 α多样性指数分析

α多样性分析结果如表1所示。在97%相似性水平下，样品的OTU覆盖率都大于99.8%，说明测序结果能够真实反映再造烟叶生产中物料的细菌多样性情况。此外，BP_4萃取后挤干物料的物种丰富度指数和Chao指数最高，说明萃取后挤干烟物料的细菌丰度最高。BP_8新鲜涂布液和BP_23上毛毯积浆的物种丰富度指数和Chao指数最低，说明新鲜涂布液和上毛毯积浆的细菌丰度和均匀性最低。BP_3预萃后烟梗的香农指数和Inverse Simpson指数最高，说明预萃后烟梗的细菌多样性程度最高。BP_8新鲜涂布液的香农指数和Inverse Simpson指数最低，说明新鲜涂布液的细菌多样性程度最低。

表1 样品细菌多样性指数Tab.1 Bacterial diversity indexes of samples

2.1.3 属水平的细菌群落结构分析

再造烟叶生产线各物料在属水平上的细菌群落结构分析表明，样品中主要的细菌属有乳杆菌属（Lactobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）和韦荣氏球菌属（Veillonella）。由图2可知，根据物料的走向和分布，优势菌属相对丰度发生以下较大变化：最初烟梗的优势菌属为魏斯氏菌属（Weissella），片烟末的优势菌属为青枯菌属（Ralstonia），经预萃和萃取后，乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度明显升高，其次为芽孢杆菌属（Bacillus）和韦荣氏球菌属（Veillonella）。其中，BP_7浓缩液、BP_8新鲜涂布液和BP_17放置2 h的浓缩液样品中乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度均在90%以上。BP_9抄前浆料经长时间存放变成BP_23上毛毯积浆后，乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度从75.98%大幅降低至1.78%，且鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）成为优势菌属。而在BP_23上毛毯积浆经过挤干压榨成基片后，BP_16基片的菌群结构又呈现与BP_9抄前浆料的细菌属结构相似的特点。

图2 样品在属水平上的细菌群落结构Fig.2 Bacterial community structure of samples at genus level

2.1.4 基于Bray-Curtis分析的属水平细菌群落结构热图

图3为基于Bray-Curtis分析并通过R语言工具绘制的样品热图。由该图可知乳杆菌属（Lactobacillus）与诸多样品关联性最强，其次是芽孢杆菌属（Bacillus）。BP_7浓缩液、BP_8新鲜涂布液和BP_17涂布液（放置2h的涂布液）样品间差异最小，表明浓缩液和涂布液细菌物种及丰度最为相似。BP_9抄前浆料、BP_13二级浆料、BP_15冲浆白水、BP_18烘箱后再造烟叶、BP_19分切后再造烟叶和BP_20打包再造烟叶聚集成同一分支，说明这6种物料中细菌属结构差异性较小。BP_1片烟末、BP_2烟梗和BP_23上毛毯积浆距离最远，表明片烟末、烟梗和上毛毯积浆与其他样品的细菌多样性及丰度差异最大。

图3 基于Bray-Curtis分析的属水平细菌群落结构热图Fig.3 Heat map of sample bacterial community structure at genus level based on Bray-Curtis analysis

2.1.5 生产过程各物料细菌群落主成分分析

物料样品细菌群落组间PCA分析结果如图4所示。主要成分PC1和PC2分别占64.95%和16.12%，两种主要成分能够解释81.07%的物种差异性，能很好地区分生产过程中各样品的细菌群落。BP_1片烟末、BP_2烟梗和BP_23上毛毯积浆和其他样品距离最远，表明细菌群落结构差异性最大。而BP_6离心后萃取液、BP_7浓缩液、BP_8新鲜涂布液和BP_17涂布液（放置2 h的涂布液）细菌群落结构相似。BP_18烘箱后再造烟叶、BP_19分切后再造烟叶和BP_20打包再造烟叶的细菌群落结构相似。PCA分析结果与2.1.4小节的热图结果基本一致。

图4 不同样品细菌属水平群落PCA图Fig.4 Principal component analysis of bacterial communities of different samples at genera level

2.2 再造烟叶生产过程真菌群落多样性分析

2.2.1 测序数据统计

对样品的真菌基因组ITS1区测序，经过滤和双端拼接后，除样品BP_22木浆板未得到测序结果外，24个样品共获得了1 690 404条有效序列，平均长度为219 bp，得到665个OTU。使用UNITE真菌分类学数据库对每个OTU的代表序列进行物种注释，共注释得到26个门、70个纲、157个目、281个科、165个属和454个种水平的真菌微生物。

2.2.2 α多样性指数分析

在97%相似性水平下，由表2可知样品的OTU覆盖率都在99.9%以上，说明测序结果能够真实反映再造烟叶生产线的真菌多样性情况。在各样品中，BP_5一级挤干后萃取液的物种丰富度指数和Chao指数最高，说明一级挤干后萃取液的真菌丰度最高。BP_25再造烟叶成品（2015年）的物种丰富度指数和Chao指数最低，说明再造烟叶成品（2015年）的真菌丰度和均匀性最低。由表2可知，BP_13二级浆料和BP_18烘箱后再造烟叶的香农指数和Inverse Simpson指数最高，说明二级浆料和烘箱后再造烟叶的真菌多样性程度最高。其中BP_2烟梗的香农指数和Inverse Simpson指数最低，说明烟梗的真菌多样性程度最低。

表2 样品真菌多样性指数Tab.2 Fungal diversity indexes of samples

2.2.3 属水平真菌群落结构分析

由图5可知，样品中主要的真菌属有假丝酵母属（Candida）、曲霉属（Aspergillus）、桑帕约氏酵母（Sampaiozyma）和丝孢酵母属（Trichosporon）。在再造烟叶生产过程中，优势菌属相对丰度发生如下变化：烟梗经预萃后假丝酵母属（Candida）相对丰度从64.88%降低至36.28%，曲霉属（Aspergillus）成为优势菌属。白水和各级浆料中的优势菌属为假丝酵母属（Candida）。浓缩液调配成涂布液后，桑帕约氏酵母（Sampaiozyma）取代假丝酵母属（Candida）成为优势菌属。经过不断的烘干和水分的降低，再造烟叶在打包后，耐干霉菌属（Xeromyces）占比从1.89%增加到30.08%，成为打包再造烟叶的优势菌属。对于成品再造烟叶，随着存放时间的延长，新鲜再造烟叶、再造烟叶成品（2016年）和再造烟叶成品（2015年）的真菌菌群结构发生较大变化，德巴利酵母属（Debaryomyces）相对丰度逐渐增加。

图5 样品在属水平上的真菌群落结构Fig.5 Sample fungal community structure at genus level

2.2.4 基于Bray-Curtis分析的属水平真菌群落结构热图

由图6可知，假丝酵母属（Candida）与诸多样品关联性最强，其次是曲霉属（Aspergillus）。BP_9抄前浆料与BP_13二级浆料样品间差异性最小，即抄前浆料和二级浆料的真菌物种多样性最为相似。BP_7浓缩液、BP_8新鲜涂布液、BP_17涂布液（放置2 h的涂布液）和BP_20打包再造烟叶聚集成同一分支，说明该4种物料中真菌物种多样性差异性较小。由于再造烟叶成品（2016年）存在大量其他真菌属以及再造烟叶成品（2015年）中德巴利酵母属（Debaryomyces）有较高丰度，使得两者与其他样品的真菌物种多样性差异最大。

图6 基于Bray-Curtis的属水平真菌群落结构热图Fig.6 Heat map of sample fungal community structure at genus level based on Bray-Curtis analysis

3 讨论

利用高通量测序技术对再造烟叶生产中25个物料样品进行细菌16S rRNA V3-V4区和真菌ITS序列分析，其中木浆板未得到细菌和真菌测序结果，推测原因是木浆原料为漂白针叶木浆（化学浆），其加工过程加入了较多的漂白剂，且木浆板本身营养物质匮乏，微生物很难存活，导致木浆板细菌和真菌数量极少，故没有获得测序结果。另外，2015年再造烟叶样品和2016年再造烟叶样品未获得细菌测序结果，推测原因为再造烟叶成品存放环境密闭干燥、水活度低，不适宜大多数微生物的存活。

除片烟末、上毛毯积浆和再造烟叶成品，总体上，其他物料样品在细菌属水平上的优势菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）和韦荣氏球菌属（Veillonella），在真菌属水平上优势菌属为假丝酵母属（Candida）、曲霉属（Aspergillus）、桑帕约氏酵母（Sampaiozyma）和丝孢酵母属（Trichosporon），这与前人报道［8-9］的再造烟叶生产中物料的优势菌属大体一致；部分不一致的结果如酿酒酵母属（Kazachstania）在本研究中为非优势菌属，可能原因是由不同生产线和生产原料来源导致的微生物差异。所有物料样品中，片烟末中特有一个细菌优势属——青枯菌属（Ralstonia），这与汪汉成等［10］报道的利用高通量测序健康烟草植株细菌多样性获得的结果相符，其研究结果显示青枯菌属（Ralstonia）为优势细菌属，相对丰度为40.61%。上毛毯积浆的优势细菌属为鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium），该菌属也为赵丰等［11］在造纸过程中发现的可培养的优势细菌属之一。

从萃取到制涂布液过程中，水溶性糖含量明显升高且渗透压变大，而乳杆菌属（Lactobacillus）具有兼性厌氧、耐酸糖和生长温度范围广的特性，因此该过程中细菌乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度逐渐增加，而真菌假丝酵母属（Candida）相对丰度总体逐渐降低。在抄造过程中，损纸浆和木浆携带的韦荣氏球菌属（Veillonella）具有厌氧特性，因而只在制浆后的液体物料中为优势属；白水经离心净化后，乳杆菌属（Lactobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、韦荣氏球菌属（Veillonella）相对丰度均有一定程度降低；浆料经过逐步的烘干工艺变成干物料后，不耐热微生物如乳杆菌属（Lactobacillus）、韦荣氏球菌属（Veillonella）、丝孢酵母属（Trichosporon）以及鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）相对丰度降低；再造烟叶成品分切打包过程中，细菌属和真菌属种类、总数量和相对丰度基本保持不变。再造烟叶成品在长时间放置储存后，由于再造烟叶本身水分含量较低以及存放环境干燥密闭，抑制了大部分微生物的生长，但兼性厌氧的德巴利酵母属（Debaryomyces）可能由于适应性较强［12］而相对丰度逐渐增加，成为再造烟叶成品样品的主要优势真菌属。由此可见，在再造烟叶的生产过程中，微生物种类多样性整体呈现先增加后减少的趋势，原因是过程物料多为固液混合物，并且营养物质相对均匀和丰富，同时过程环境湿热，有利于各类微生物的生长和繁殖，而原料和成品为固态，含水率低，存放环境相对密闭干燥，不利于微生物的生长和繁殖。

优势细菌属乳杆菌属（Lactobacillus）的大量繁殖会消耗再造烟叶中的糖类等有机质产生大量乳酸，导致涂布液和白水腐败变酸，从而影响再造烟叶品质。该菌属制约着涂布液的储存周期和白水的循环使用次数，导致生产过程需要定期对生产系统进行停机清洗［13］，因此采用合适的方法降低/抑制再造烟叶生产线乳杆菌属（Lactobacillus）的生长繁殖对于提升生产中的连续性和稳定性非常有必要。优势真菌属曲霉属（Aspergillus）在再造烟叶储藏过程中易引起霉变［14］；同时该属中也存在一些有利于烟草香气提升的菌种，高文霞等［15］从烟叶中分离筛选出的一株曲霉菌Aspergillus sp.SZ14可明显增加烟叶中有机酸和石油醚的含量从而提升烟草品质，所以对于曲霉属（Aspergillus）微生物可进行针对性管控。

芽孢杆菌属（Bacillus）细菌在生产过程各物料样品中均有分布，该菌属微生物不仅具有耐高温的特点，很多菌种还具有很强的酶分泌能力，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）等能分泌蛋白酶、淀粉酶、果胶酶到胞外，进而通过降解萃取液与浓缩液中的蛋白质、淀粉、果胶等生物大分子物质而促进产香，因而该菌属可作为有益的微生物资源进行挖掘利用［16-17］。

4 结论

利用高通量测序技术对再造烟叶生产过程中各物料样品微生物群落多样性进行了分析，结果共检测出393个细菌属和165个真菌属，各物料在加工过程中细菌属的丰度和种类变化相对较小，而真菌属的变化相对较大。总体上，物料样品在细菌属水平上的优势菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）和韦荣氏球菌属（Veillonella），真菌属水平上优势菌属为假丝酵母属（Candida）、曲霉属（Aspergillus）、桑帕约氏酵母（Sampaiozyma）和丝孢酵母属（Trichosporon），且在再造烟叶的生产过程中，微生物种类多样性整体呈现先增加后减少的趋势。