云烟净油的制备及主要成分

许克静，蔡莉莉，席高磊，王清福，王二彬，赵学斌，项 攀，刘前进，陈芝飞

河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州市经开区第三街8号 450000

烟草净油是一种从烟草中提取并通过脱色、脱蜡等工艺处理后得到的烟草提取物［1-3］，具有多种挥发性和半挥发性致香成分，对卷烟感官品质和风格特征有显著影响。常见的烟草净油提取方式有溶剂萃取［2-5］、水蒸气蒸馏［6-8］、同时蒸馏萃取［9］、超临界CO2萃取［10-12］、分子蒸馏［13-15］、微波辅助提取［16］等。其中，超临界CO2萃取技术是一种安全高效的提取技术［11-12］，被广泛应用于烟草提取物的制备以及茄尼醇、烟碱等功能性成分的提取［10］。由于超临界CO2萃取技术对弱极性成分不具有选择性，造成烟草超临界提取物成分复杂，含有大量不良风味的化学成分。要制备作用效果显著的超临界烟草净油，则需要进一步脱除不良风味成分。然而，目前超临界CO2萃取烟草提取物的研究主要集中在萃取温度、压力和时间的工艺优化方面［12］，鲜有对烟草超临界提取物的后续精制研究的报道。

烟草蜡质作为烟草超临界提取物中的一类重要成分，主要是指烟草中C18～C34之间的正构或异构高级烷烃，主要集中在烟叶表面，作为植物叶片的表面屏障，可减弱紫外线对植物的损害、防止自由水的损失［17-19］。刘菲等［17］采用超声辅助萃取技术对云烟87品种烟叶中的高级烷烃进行提取分析，发现蜡质最高可达1 614.5μg/g，其中，在C25～C35之间的烷烃占烷烃总量的99%。目前，有关烟草蜡质的研究主要集中在烟叶烷烃成分分析［17-19］、烟丝保润性［20］及烟草保水性［21］等方面，而有关蜡质成分对卷烟风味特征影响的研究较少。因此，本研究中以云南清香型烟叶模块碎片为原料，通过超临界CO2提取、乙醇脱蜡和冷冻离心等工艺，制得云烟超临界提取净油及其蜡质脱除物；通过GC-MS分析和感官质量评价，确定各组分的化学组成及感官作用，旨在为烟草超临界提取物的精制化研究及烟草特征成分分析提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

云南清香型烟叶模块在打叶复烤环节产生的烟叶碎片［昆明DCJ59sp，其叶组信息为昆明C1F（12.50%）、文山C1F（8.33%）、红河C1F（5.56%）、昆明C2F（37.50%）、昆明C3F（5.56%）、大理C2F（8.33%）、麒麟C2F（2.78%）、麒麟C3F（8.33%）、红河C2F（11.11%）］由河南中烟工业有限责任公司提供。

95%乙醇（AR）、乙酸苯乙酯（色谱纯）（阿拉丁生化科技股份有限公司）；水杨酸乙酯（色谱纯）、二氯甲烷（AR）（国药集团化学试剂有限公司）。

HA220-40-15型超临界CO2萃取装置（南通市华安超临界萃取有限公司）；7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；R-210旋转蒸发仪（瑞士Büchi公司）；GL-10MD冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；BW200S电子天平（感量0.000 1 g，北京赛多利斯公司）；BL-3000型台式中药材粉碎机（浙江省台州巴菱电器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理

称取一定量的烟叶碎片置于粉碎机料斗中，选择孔径为0.9 mm（20目）的筛网用于控制粉碎粒径，收集筛分后的粉末并置于密封袋中常温保存。

1.2.2 超临界CO2提取

称取1.0 kg烟叶粉末置于5 L萃取釜中，密闭萃取釜后设置超临界提取参数：超临界提取压力30 MPa，提取温度40℃，CO2提取流量35～40 L/h；分离釜Ⅰ压力8 MPa，分离温度40℃；分离釜Ⅱ压力4 MPa，分离温度45℃；提取时间2 h。提取结束后，打开分离釜出料口，收集萃取物；室温静置分层，除去水层后得超临界提取物（记为YS0），提取率为3.15%。

1.2.3 醇提脱蜡

超临界提取物的制备及脱蜡工艺流程见图1。准确称取500.0 g YS0，置于10 L圆底烧瓶中，再加入10倍质量的95%乙醇使其溶解；然后将圆底烧瓶置于80℃水浴中，加热搅拌10 min后，体系分为上下两层。将分离后的上层乙醇溶液冷却至室温，－5℃冷冻离心分离得到123.0 g固体析出物（W1，得率24.6%）和滤液，滤液经浓缩后得278.0 g脱蜡产物（YS1，得率55.6%）；将下层非醇溶性液体冷却至室温后得到99.0 g蜡质（W2，得率19.8%）。

图1 云南烟叶超临界提取物制备及脱蜡工艺流程Fig.1 Preparation and dewaxing process of supercritical extract of Yunnan tobacco

1.2.4 GC-MS分析方法

采用GC-MS法对超临界提取物和醇提脱蜡产物进行定性分析。

准确称取0.50 g待分析样品于容量瓶中，然后加入5 mL内标溶液，超声5 min以使样品完全溶解；然后取1 mL溶液加入色谱瓶中。其中，内标物为水杨酸乙酯，溶剂为二氯甲烷，内标溶液浓度为3.131 6 g/L。采用NIST14数据库对色谱图进行检索定性（匹配度≥90%），以面积归一化法定量。GC-MS分析条件：

色谱柱：HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25μm）毛细管柱；进样口温度：310℃；载气：He，1 mL/min；进样量：1μL；分流比：15∶1；程序升温：50℃（4 min）；溶剂延迟：5 min。电离方式：电子轰击离子源（EI）；离子源温度：230℃；电离能量：70 eV；传输线温度：280℃；四极杆温度：150℃；隔垫吹扫流量：3 mL/min；扫描方式：全离子扫描（Scan）模式；质量扫描范围：33～550 amu。

1.2.5 超临界提取率和蜡质脱除率的计算方法

按照公式（1）计算超临界提取物的提取率（%）：

式中：m1为超临界提取物的质量，g；m0为烟末投料质量，g。

按照公式（2）计算蜡质脱除率：

式中：Ai为扣除溶剂峰后蜡质的峰面积；n为组分的数量；As为扣除内标的谱图峰面积。

1.2.6 感官评价

依据YC/T 138—1998［22］的方法，将制备的样品按0.02 mg/g的加香量施加于烟丝上，经平衡水分等相应处理后，由卷烟感官评价专家小组（9人）进行评吸，对香气质、香气量、透发性、杂气、浓度、劲头、细腻程度、成团性、刺激性、干燥感、干净程度、回甜等12个指标分别评分（各项指标分值越高越好），取9位评委对单项指标评分的平均值作为该项指标的得分。

2 结果与讨论

2.1 醇提脱蜡工艺结果分析

根据超临界提取浸膏中的致香成分与高级烷烃在溶剂中的溶解性差异，采用溶剂脱蜡法实现蜡质的脱除。本研究中以95%乙醇作为脱蜡溶剂，用10倍质量的95%乙醇加热萃取出浸膏中的致香成分。由于蜡质在乙醇中溶解度较低，加热条件下出现一部分溶于乙醇（上层）和一部分密度大于乙醇的熔融物（下层）。将上、下两层分离后冷却至室温，下层直接凝固得到一种蜡质脱除物，上层经冷冻离心后得到另一种蜡质脱除物。两种蜡质成分相对质量百分数分别为19.8%和24.6%，其总和占超临界提取浸膏总量的44.4%。可见，直接通过超临界提取技术所得超临界提取浸膏中蜡质的质量百分数较高。通过脱蜡处理，可有效降低超临界提取物中的蜡质成分。

2.2 超临界提取物各组分的GC-MS分析

为了进一步明确脱蜡工艺的脱蜡效果，通过GC-MS分析确定超临界提取物各组分的化学成分。

YS0的GC-MS分析结果如图2、表1和表2所示。由图2可知，超临界提取浸膏中化学成分复杂，出峰保留时间主要集中在30～55 min之间。共鉴定出56种化合物（表1和表2），主要包括生物碱类（4种）、醇类（10种）、烃类（13种）、酸类（9种）、酮类（12种）、酯类（3种）、酚类（3种）、吡啶类（1种）、吡喃类（1种）。关键致香成分主要有烟碱、巨豆三烯酮、二氢大马酮衍生物、吡喃酮、新植二烯、西柏三烯二醇等，共占挥发性致香成分出峰面积的72%（相对质量分数达157.69 mg/g）。其中，烟碱质量分数较高，峰面积所占比例达49.55%（相对质量分数达98.15 mg/g）。虽然烟碱是烟草提取物中的关键成分，但高质量分数的烟碱会引起卷烟劲头增大、舒适性降低。由表1可以看出，YS0中主要含有C19～C32的12种蜡质烷烃。烟草提取物中的蜡质往往对卷烟烟气产生一定的负面作用，比如烟气粗糙感增加、口腔残留明显等。值得注意的是，虽然在GC-MS分析时蜡质成分的出峰面积仅占所有挥发性致香成分面积的5.15%，但在脱蜡工艺中蜡质的质量所占比例却达到44.4%。说明蜡质成分在GC-MS分析中的响应强度较低，易被其他挥发性成分掩盖，这可能就是烟草超临界提取物中蜡质往往被忽视的重要原因。

表2 云烟超临界提取物各组分GC-MS匹配的非蜡质成分及相对质量分数Tab.2 Non-waxy components and their relative mass fractions of each component of Yunnan tobacco supercritical extracts matched by GC-MS

图2 云烟超临界提取浸膏（YS0）的总离子流图Fig.2 Total ions current chromatogram of supercritical extract of Yunnan tobacco（YS0）

由图3、图4和表1可知，云烟超临界提取浸膏通过乙醇脱蜡工艺后，主要得到C25～C33的21种蜡质烷烃。其中，正构烷烃9种（分别是C25～C33的直链正构烷烃），支链烷烃12种（主要为2-位和3-位甲基取代的C27～C33支链烷烃）。除9-辛基二十烷仅在W1中检出外，其他蜡质烷烃均在W2中检出。说明支链化程度高的蜡质烷烃较支链化程度低的在乙醇中的溶解度更大。另外，3-甲基二十七烷、二十八烷、2-甲基二十九烷、2-甲基三十一烷、3-甲基三十二烷和3-甲基三十三烷6种蜡质烷烃仅在W2中检出，说明该6种烷烃在乙醇中的溶解性较其他烷烃低。值得注意的是，十九烷和二十烷仅在YS0和YS1中检出，而在W1和W2中未检测到。这可能是由于C20及以下的正构烷烃在乙醇中的溶解性良好，通过在乙醇中的溶解性差异不能很好地脱除低分子量的蜡质。从结构特征上可以看出，烟草在代谢过程中，支链烷烃一般以2-位或3-位甲基形式出现，且较少出现更为复杂的支链烷烃［23］。

图3 云烟超临界提取浸膏的蜡质脱出物（W1）的总离子流图Fig.3 Total ion current chromatogram of wax components（W1）in Yunnan tobacco supercritical extract

图4 云烟超临界提取浸膏的蜡质脱出物（W2）的总离子流图Fig.4 Total ion current chromatogram of wax components（W2）in Yunnan tobacco supercritical extract

表1 云烟超临界提取物各组分的蜡质成分及相对质量分数Tab.1 Waxy chemical components and their relative contents in supercritical extract of Yunnan tobacco

表2（续）

YS0的脱蜡产物（YS1）的GC-MS分析结果如图5和表2所示。可知，将蜡质成分脱除后，挥发性致香成分进一步富集，GC-MS共鉴定出61种化合物，主要包括生物碱类（3种）、醇类（19种）、烃类（5种）、酸类（11种）、酮类（12种）、酯类（6种）、酚类（3种）、吡啶类（1种）和吡喃类（1种）等9类化合物。与YS0对比发现，YS1中醇类和烃类成分变化明显，醇类成分多出9种，烃类成分减少8种。同时，除化学成分种类的变化外，各单组分的相对质量分数也变化显著。其中，相对质量分数均有所增加的达55种；典型致香成分如巨豆三烯酮、西柏三烯类化合物、莨菪亭、植醇等增加明显；脂肪酸的相对质量分数变化也十分显著，十四酸、十五酸、十六酸、十七酸、亚油酸、亚麻酸、硬脂酸和二十酸的总量由14.4 mg/g增加至203.18 mg/g；天然维生素E（生育酚A、生育酚B和生育酚C）的相对质量分数则由9.31 mg/g显著增加至107.12 mg/g。值得注意的是，烟碱在YS0和YS1中的相对质量分数变化并不显著，但烟碱在总挥发性成分中的相对比例则由49.55%降低至13.07%。说明乙醇脱蜡工艺具有一定的烟碱脱除作用，同时对其他挥发性成分的富集作用明显。另外，通过对比蜡质成分质量分数发现，YS1中仅保留十九烷和二十烷两种烷烃，而其余21种高级烷烃均被有效脱除，蜡质成分的脱除率高达99.83%。说明乙醇溶剂具有很好的蜡质脱除效果。

图5 云烟超临界提取净油（YS1）的总离子流图Fig.5 Total ion current chromatogram of essential oil（YS1）of Yunnan tobacco supercritical extract

另外，蜡质等成分被脱除后，烟草净油中的甾醇类化合物得到进一步富集，共鉴定出胆固醇、菜油甾醇、豆甾醇、γ-谷甾醇、（3β，24Z）-豆甾-5，24（28）-二烯-3-醇、β-香树脂醇和环阿屯醇等7种甾醇类化合物。这些化合物中，除胆固醇、菜油甾醇、豆甾醇和γ-谷甾醇有文献报道［24-25］外，其他甾醇化合物在烟草提取物成分分析中鲜有报道。研究表明，烟草中的甾醇在高温裂解时可产生苯并芘等致癌类稠环芳烃［24-26］，掌握烟草中甾醇的种类和质量分数对卷烟“减害增香”具有重要的研究意义。

2.3 云烟超临界提取物各组分在卷烟中的感官作用评价

云烟超临界提取物各组分在卷烟中的感官作用评价结果如表3所示。可知，相比于空白卷烟，YS0在提升香气质和香气量方面效果显著，同时烟气浓度、回甜、透发性、成团性增加，刺激性降低；能增强云南烟草特征香气，清甜感显著，烟气爆发力增强。但口感特征上有一定的残留，舌面颗粒感明显。W1和W2的感官质量则明显变差，主要表现为烟气粗糙、口腔残留明显，有明显的蜡质感，香气质、香气量降低，刺激性增加。通过GC-MS分析可知，W1和W2主要含有C25～C33的蜡质成分，而在YS0中除含有一定量的烟草特征致香成分外，仍含有45%左右的蜡质成分。因此，在口感特征上均表现出一定的蜡质感。

表3 云烟超临界提取物各组分的卷烟感官质量评价结果Tab.3 Evaluation sensory quality of components in Yunnan tobacco supercritical extract added to cigarette

相比于空白卷烟和YS0，脱蜡后所得净油（YS1）在香气特征、烟气特征和口感特征上改善显著，主要表现为香气质和香气量较空白增加显著，同时比YS0也有显著改善；烟气浓度增加，细腻程度和成团性也显著改善；口感特征表现为刺激性降低、回甜感增加显著，同时口腔残留明显减小，无明显蜡质感。相较于W1和W2的副作用，YS1的正向作用明显，有效改善了卷烟的口感特征。

综合YS0、W1、W2和YS1的感官对比评价结果，YS1的作用效果最好，YS0次之，而W1和W2的作用效果则较差，说明超临界提取物中的蜡质对卷烟感官质量存在显著副作用。通过脱蜡工艺除去云烟超临界提取浸膏中的蜡质成分可有效改善浸膏的卷烟感官作用效果，降低对感官质量的不利影响，提升卷烟品质。

3 结论

①通过烟草超临界提取物脱蜡方法，21种C25～C33的蜡质烷烃得到有效脱除，蜡质脱除率高达99.83%，烟草净油中挥发性致香成分、烟草甾醇和天然维生素E得到有效富集。②同时发现（3β，24Z）-豆甾-5，24（28）-二烯-3-醇、β-香树脂醇和环阿屯醇等3种新型烟草甾醇。③感官评价结果表明，烟草超临界提取物脱蜡后可有效改善卷烟感官作用效果，降低对口感的不利影响，提升卷烟品质。