STING-IRF3信号通路参与内质网应激介导的心肌自噬流损伤

李媛彬，陈 歆，邱爱珠，丘继哲，袁湘莲，陈 壮*

（湖南中医药高等专科学校医学院，湖南 株洲 412012）

0 前言

心肌缺血再灌注（I/R）损伤引起的心肌细胞死亡是临床再灌注治疗中并发症发生的主要危险因素[1]。因此，如何有效地减少心肌I/R中的细胞死亡是一个亟待解决的问题。内质网应激作为胞质信号网络的整合者，与氧化应激、泛素蛋白酶体途径和炎症反应相关，参与心血管疾病的发生发展[2]。

研究表明内质网应激可引起再灌注后心肌的自噬，细胞自噬可降解内质网中无功能的错误折叠蛋白，以减轻内质网应激和未折叠蛋白反应[3]。内质网应激诱导的自噬可能与缺血的持续时间和严重程度有关。在轻度缺血时诱发细胞自噬导致ATP增加保证细胞的能量供应，而在重度缺血时伴发自噬流受损而造成细胞死亡。换句话说，适度的内质网应激诱导的自噬对心肌细胞有保护作用，但过度或强烈的内质网应激会阻碍自噬流引起心肌细胞死亡。因此，探讨内质网应激与心脏自噬的潜在关系及机制具有重要意义。

干扰素基因刺激因子（STING）通常位于内质网膜上，可被病毒感染、内质网应激、游离细胞质DNA等因素激活[4]。STING参与了各种疾病中的炎症和免疫反应。Petrasek J[5]等发现内质网应激可激活STING-IRF3信号通路，导致酒精性肝病肝细胞死亡。下调STING蛋白水平后，可以有效抑制IRF3磷酸化和肝脏损伤。最近的研究表明，STING参与内质网应激[6]介导的病理性心肌肥厚和纤维化。但STING-IRF3通路是否参与I/R后过度内质网应激对心肌自噬流的抑制作用尚未明确。

在本研究中，我们试图研究干预内质网应激后对心肌I/R损伤后心肌自噬流及STING-IRF3信号通路的体内外影响，并进一步探讨这些过程的潜在机制。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

野生型C57BL/6（10-12周龄）小鼠购于湖南斯莱克景达实验动物公司；H9c2细胞购于上海Sciencell公司；STING、磷酸化TBK1（p-TBK1）、TBK1、磷酸化IRF3（p-IRF3）、IRF3和p62兔单克隆抗体以及羊抗兔抗体购自美国CST公司；Real time PCR试剂盒购于Promega公司；Rubicon引物由上海生工公司合成；4-PBA（CAS:1821-12-1）购自美国Sigma公司。

1.2 心肌I/R模型的建立

雄性野生型C57BL/6（10-12周龄）小鼠用2%异氟醚麻醉后，留置针气管插管（经口），外置呼吸支持系统。在胸骨左缘第四肋间隙暴露心脏，用7-0缝线结扎左冠状动脉左前降支30min。PowerLab系统显示ST段抬高，作为结扎成功的标志。结扎30min后，解除结扎，心脏颜色恢复红色时，关闭皮肤切口。所有小鼠均饲养在特定的无病原体动物房中，并按照实验动物伦理委员会准则进行处理。

1.3 超声心动图评估心脏功能

小鼠麻醉后，使用经胸二维超声心动图，在胸骨旁左室长轴视图上测量左室舒张末期内径（LVIDd）和左室收缩末期内径（LVISd），接着采用Vevo Analysis软件（version3.0.0）分析左室缩短分数（LVFS）和左室射血分数（LVEF）的百分比。

1.4 染色质免疫沉淀（ChIP）和聚合酶链反应（PCR）

将按实验方案处理后的H9c2细胞与1%甲醛室温交联20分钟。接着把细胞与甘氨酸（最终浓度为0.125 mol/L）孵育5分钟终止交联。细胞DNA通过超声波破碎。用IRF3抗体免疫沉淀蛋白-DNA复合物，然后用PCR检测IRF3/Rubicon启动子复合物。IgG作为阴性对照。Rubicon扩增引物为：F5'-GTCCCCTGACATATCGTAGACT-3'，R5'-TGAAGAAGGCATTGGGTGGA-3'。

1.5 细胞培养及H/R模型

H9c2细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养24-36小时，转移至三气培养箱（含5%二氧化碳和95%N2）在37°C培养6h后,在含5%CO2和95%O2，10%胎牛血清的DMEM条件下复氧18h，复制缺氧/复氧（H/R）模型 。

1.6 免疫印迹

心肌组织或细胞在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中匀浆，然后蛋白质样品通过10%SDS -聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）进行分离，转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（美国Millipore）。用5%脱脂奶粉封闭，与STING、p-IRF3、IRF3（1:3,000）4℃孵育过夜，用含0.1%吐温-20的TBST冲洗膜3次（每次10分钟）后，再与HRP交联的二抗室温孵育2h。TBST冲洗膜3次后，使用ECL（Thermo Fisher Scientific,32106）观察免疫反应蛋白条带，并用Alpha Imager 2200进行定量。

1.7 统计学处理

数据均采用均数±标准差表示，用SPSS 22.0进行统计学分析，对多组采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抑制内质网应激减轻心肌I/R损伤

与假手术组小鼠相比，I/R组小鼠的血清肌酸激酶（CK）水平明显升高；与I/R组小鼠相比，4-PBA预处理组小鼠血清CK水平显著降低，见图1。此外，超声心动图检查显示，与假手术组小鼠相比，I/R组小鼠的LVFS和LVEF值显著降低；而4-PBA处理改善了小鼠I/R后的心功能，心室FS、EF均提高，见图1。这些结果表明，抑制内质网应激可能在心肌I/R损伤后心脏功能的维持中发挥了重要作用。

图1 心肌组织中p62、Rubicon表达水平

表1 各组小鼠血清 CK-MB含量和心功能指标变化

2.2 抑制内质网应激增加心肌I/R损伤后自噬流

进一步探讨抑制内质网应激改善心肌功能的可能机制是否与心肌I/R损伤后细胞自噬增加有关。如图1所示，I/R组小鼠心肌组织中p62和Rubicon表达水平升高，用4-PBA预处理后，p62和Rubicon的表达明显发生逆转。

2.3 抑制内质网应激下调心肌I/R损伤后STING-IRF3通路介导的自噬负调控分子的表达

接着检测内质网应激是否为STING-IRF3信号通路激活的潜在机制。结果显示，STING、p-TBK1和p-IRF3的蛋白水平在再灌注12h后显著升高，而与I/R组相比，4-PBA处理降低了STING、p-TBK1和p-IRF3的蛋白水平，见图2（P287）。我们的研究结果表明，抑制内质网应激下调了I/R诱导的心肌组织中STING-IRF3信号的激活。

图2 心肌组织中STING、p-TBK1、p-IRF3表达水平

ChIP-PCR结果进一步证实，H/R处理增加了IRF3对Rubicon启动子的结合，而4-PBA则降低了这种相互作用，见图3。总的来说，这些结果表明STING-IRF3信号通路通过与Rubicon结合阻断自噬流。

图3 ChIP-PCR检测H9c2细胞中IRF3与Rubicon启动子的结合Ctrl：正常组，H/R：缺氧复氧组

3 讨论

在本研究中，我们证实了内质网应激诱导的STINGIRF3信号通路参与了心肌I/R损伤发病过程的新作用。我们观察到小鼠心肌再灌注损伤后STING、p-TBK1和p-IRF3的表达显著升高。内质网应激抑制剂4-PBA能够促进心肌自噬，降低血清CK-MB水平，改善心肌收缩功能。此外，4-PBA预处理可以抑制心肌I/R后的STING-IRF3信号活化，从而减轻心肌损伤。体外分析进一步证实了STING-IRF3信号通路和自噬分子之间的相互作用。这些结果提示，内质网应激与心肌I/R中自噬障碍之间存在潜在的相关性，但具体的机制有待进一步探讨。

众所周知，自噬有利于心肌细胞存活，自噬的激活可能是内质网应激活化后在再灌注损伤发展过程中的相关代偿机制。内质网应激激活后，自噬活性增加，参与折叠或错误折叠蛋白的降解和去除。然而，I/R损伤时自噬小体清除障碍，导致细胞死亡。因此，参与自噬流受损相关的内质网过度应激可能是导致心肌I/R损伤的机制之一。那么内质网应激是如何调节自噬导致细胞死亡的机制尚不清楚。

Rubicon是自噬小体/核内体成熟的负调控因子[7]。Rubicon缺乏可增强心脏自噬，保护小鼠免受LPS诱导的损伤[8]。我们的结果证实I/R损伤上调心肌组织中STINGIRF3信号通路，STING-IRF3通路是否直接参与心肌I/R诱导的自噬流障碍还不得而知。在进一步实验中，我们发现内质网应激介导的STING-IRF3信号通路通过IRF3结合Rubicon，促进Rubicon的表达，从而抑制心肌细胞自噬流。这些数据再次表明，自噬受损与心肌I/R损伤中的STING-IRF3信号通路活化相关。

近来研究发现，miR-24-3p通过调控STING的表达，在肝脏I/R[9]过程中抑制炎症，缓解细胞凋亡。在小胶质细胞中，HDAC3-p65-cGAS-sting通路参与了I/R诱导的神经炎症，体内实验表明，缺失小胶质细胞cGAS或HDAC3可减轻I/R诱导的脑损伤和神经炎症[10]。与上述结果一致，我们的数据表明，内质网应激是激活STING的上游因子，4-PBA通过调节内质网应激诱导的STING- IRF3信号通路，在I/R过程中发挥心脏保护作用。因此，这些发现进一步证实了干预这一通路是防治心肌细胞死亡以及再灌注后心律失常和心力衰竭并发症的潜在靶点。

综上所述，我们明确了STING-IRF3是心肌I/R损伤病理过程中的关键信号通路，其通过与Rubicon结合抑制心肌自噬流；4-PBA通过降低STING-IRF3活化和促进自噬流在I/R期间发挥心脏保护作用。