犊牛溶血曼氏杆菌疫苗免疫安全性及效果评价

孟文文，商云鹏，赵卓，高荣荣，曹杰

（1.中国农业大学动物医学院，北京 100193；2.北京生泰尔科技股份有限公司，北京 102600）

溶血曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica,M.haemolytica）是引起牛、羊等反刍动物呼吸系统疾病的主要病原之一，全球广泛流行，可导致牛、绵羊肺炎以及新生羔羊急性败血症等[1]。溶血曼氏杆菌也是牛呼吸系统疾病综合征（Bovine respiratory disease complex，BRDC）的主要细菌性病原[2]，可引发肉牛和奶牛地方性肺炎。尽管饲养管理水平不断提高，但呼吸系统疾病仍是牛场面临的主要疾病。国内奶牛场近几年由溶血曼氏杆菌引起的犊牛肺炎及成母牛肺炎有升高趋势，呈现发病急、抗生素治疗效果不佳、死亡率高的特点。疫苗免疫是控制该传染病的主要方法，安全优质的疫苗和科学合理的免疫程序直接关系到免疫效果[3]。本试验选择2～6月龄健康荷斯坦犊牛，采用溶血曼氏杆菌灭活疫苗免疫，评价疫苗安全性，并通过白细胞毒素中和试验监测免疫后抗体消长规律，为溶血曼氏杆菌病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及免疫时间

试验在山东某万头牧场进行，该牧场2019年冬季4～6月龄犊牛曾发生牛溶血曼氏杆菌肺炎。将该牧场2～6月龄共计2 500头健康犊牛纳入试验。于2020年9月份进行首次免疫，2020年10月进行二次免疫。

1.2 疫苗及试剂

牛溶血曼氏杆菌灭活疫苗（A1型M164株），北京华夏兴洋生物科技有限公司生产，批号：2020001；MEM培养基，购自Gibico公司；BL-3细胞，购自ATCC，编号CRL-8037，批号011782；标准溶血曼氏杆菌白细胞毒素（320CU/mL）、牛溶血曼氏杆菌阳性及阴性血清对照，北京生泰尔科技股份有限公司保存；兽用体温计，购自九江鑫康医用仪表有限公司。

1.3 试验方法

参试犊牛颈部皮下注射牛曼氏杆菌灭活疫苗（A1型M164株），每头2.0mL，首次免疫后21d加强免疫。

1.3.1 免疫后不良反应观察

疫苗注射后10d内，观察免疫犊牛是否出现过敏反应、采食量变化、体温变化，同时观察注射部位局部反应及精神沉郁等全身反应。

1.3.2 免疫后抗体消长规律

选择2月龄健康犊牛20头，用于免疫前后抗体评价。首次免疫前、二免前、二免后14d、2个月、4个月、6个月时分别采血，分离血清-20℃冻存备测。

采用血清白细胞毒素中和试验法进行抗体检测，抗体效价＞1:8判定为阳性，≥1:32判定为合格（具有保护力）。步骤如下：

（1）溶血曼氏杆菌白细胞毒素含量测定。取96孔板，每孔加入50μL的MEM培养基。加入过滤的溶血曼氏杆菌白细胞毒素到第一排，每孔50μL，充分混合，每个样品重复2孔。然后由第一排样品吸取50μL到第二排，依次进行2倍倍比稀释，最后一排弃掉50μL。同时设空白对照2排。

每孔加100μL密度为2.5×105个/mL的BL-3细胞，置37℃、5% CO2培养箱孵育1h。倒置显微镜下观察各孔BL-3细胞病变结果。典型的细胞病变效应，主要表现为核固缩、细胞呈煎蛋样、破碎等过程。观察每孔细胞病变情况。以至少95%的细胞出现CPE的最高稀释倍数乘以20作为每mL培养物中白细胞毒素含量的测定结果，以2个重复孔的测定结果平均值作为含量测定的最终结果。如：检测结果的最高稀释倍数为32倍（稀释度为1:32），则白细胞毒素含量为640CU/mL（CU为白细胞毒素单位）。

（2）白细胞毒素中和试验法测定抗体效价。培养BL-3细胞至2.5×105个/mL。取96孔板，每孔加入50μL pH 7.0的MEM培养基。加50μL血清样品到第1孔，倍比稀释到第12孔。每个样品做4个重复。试验同时设阳性血清、阴性血清、白细胞毒素对照、正常细胞各4孔作为对照。将曼氏杆菌白细胞毒素用MEM培养基稀释成浓度为320CU/mL，作为工作抗原。每孔加100μL的工作抗原，轻轻震动平板，使之混匀。室温孵育10min，使白细胞毒素与血清进行中和作用。每孔加入100μL BL-3细胞，置37℃、5% CO2培养箱孵育1h。

结果判定：观察每孔细胞病变情况，以至少95%的细胞出现CPE判为阳性，否则判为阴性。按Reed-Muench法计算待检血清的中和抗体效价。标准阳性血清中和抗体效价不低于1:32，阴性血清和白细胞毒素对照各孔均出现细胞病变；工作抗原回归滴定，白细胞毒素含量不低于320CU/mL；正常细胞对照孔细胞应生长良好。

1.3.3 免疫后发病犊牛鼻咽拭子及死亡犊牛肺组织病原检测

加强免疫后6个月内，采集部分呼吸道疾病犊牛鼻咽拭子及肺炎死亡牛肺组织，进行BRDC相关病原检测，确定疫苗免疫对溶血曼氏杆菌感染的保护情况。

1.3.4 数据处理

数据采用Graphpad Prism 8.0数据分析软件，t检验进行差异性分析，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 犊牛免疫后不良反应观察

2 500头犊牛免疫后，未出现呼吸急促、流涎、肌肉震颤、痉挛和死亡等急性过敏反应，免疫3d内均未出现迟发性肺水肿。

选择200头3月龄犊牛监测免疫前及免疫后3d的采食量，结果发现，免疫后平均采食量下降12%，由3.25kg/头下降到2.86kg/头，在免疫后3d恢复正常。

选择20头2月龄犊牛监测免疫前、免疫后5d的体温，同时选择20头未免疫犊牛作为对照。结果发现，免疫前、免疫后0.5h试验犊牛均未出现体温升高，有65%的牛在免疫后1～5d内出现体温一过性升高（39.6～41.3℃之间），1～2d内自行恢复。仅1头犊牛体温超过41℃，注射氟尼辛葡甲胺2.5mL后1d内恢复正常。与对照组相比，免疫组平均体温在免疫后1d及免疫后2d时极显著升高（P＜0.01）。

图1 免疫前后试验组与对照组犊牛平均体温变化

本次免疫的牛溶血曼氏杆菌疫苗含菌体和白细胞毒素两种抗原成分，接种疫苗后注射部位可能出现肿胀，应在观察期内消失，并在14日内无其他全身不良反应。免疫后每日观察犊牛注射部位及精神表现，结果发现，2 500头犊牛中有95%的牛免疫后1～2d出现注射部位皮下肿胀，其中有20%的犊牛肿胀较大，达11×7cm，厚约2cm；有41%的犊牛肿胀较小，肉眼难以发现，触诊其约5×3cm，厚约1cm。肿胀部位触诊坚硬，无热痛等炎症表现，并在1～2周内逐渐消退。全身反应方面，有5%的犊牛在免疫后1d内出现精神沉郁、体温升高、有嗜睡表现，此后逐渐恢复，其他犊牛精神状况、呼吸、采食及饮水均未见明显异常。

2.2 犊牛免疫后抗体消长规律

20头2月龄犊牛血清样品，采用白细胞毒素抗体检测法检测牛溶血曼氏杆菌抗体含量，并计算其几何平均值（表1）。结果显示，免疫前抗体含量较低，平均效价仅为1:4；二免前抗体增长幅度较高，平均效价达1:29；二免后14d抗体达到峰值，平均效价为1:54，阳性率及合格率分别为100%及95%；二免后2个月维持在较高范围内，平均效价为1:44，阳性率、合格率均为100%；二免后4个月抗体平均效价开始下降，二免后6个月降至1:23，低于临界保护值，仅45%的牛可提供有效保护，需进行加强免疫。

表1 犊牛抗体结果

2.3 免疫后犊牛鼻拭子及肺炎死亡牛病原检测

免疫后的6个月内，发生呼吸系统疾病的犊牛，在治疗前采集鼻咽拭子及肺炎死亡犊牛的肺组织，采用PCR/RT-PCR方法检测牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛支原体（MB）、多杀性巴氏杆菌（PM）和溶血曼氏杆菌（MH）四种相关病原。

试验期间共采集发病犊牛鼻咽拭子样品38份，将样品混合成7份进行检测。结果以多杀巴氏杆菌为主，其次是牛支原体，溶血曼氏杆菌以及牛传染鼻气管炎病毒均为阴性（图2）。免疫后的犊牛，呼吸系统疾病主要由巴氏杆菌及牛支原体引发，未见溶血曼氏杆菌感染。

图2 肺炎牛鼻咽拭子PCR/RT-PCR结果

试验期间共采集3份（分别命名为L1、L2、L3）死亡犊牛肺组织。死亡犊牛剖检可见肺脏与胸壁黏连，肺脏边缘以及肺大叶表面有多处坏死及出血点，胸膜点状出血，腹腔纤维素性渗出及黏连。上述3头死亡犊牛采集肺组织进行相关病原检测，结果均为牛巴氏杆菌PCR阳性，溶血曼氏杆菌、传染性鼻气管炎病毒以及支原体检测均为阴性（图3）。

图3 肺炎死亡牛肺组织PCR/RT-PCR结果

3 讨论

疫苗免疫后，动物可能会因应激反应出现精神沉郁、采食量降低或体温升高等现象，通常在3d左右即可恢复正常[4]。李建玲等研究表明，猪在注射猪瘟、口蹄疫及高致病性蓝耳病疫苗时，会出现体温升高、精神萎靡及食欲减退等不良反应，但症状不严重，均可自行恢复[5]。郭利等研究表明，牛在注射传染性鼻气管炎疫苗后，偶有出现一过性体温升高[6]。白细胞毒素是溶血曼氏杆菌产生的能引起反刍动物肺损伤及发病的一种重要炎性因子，对肺泡巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞都具有杀伤作用[7]，注射后有30%的牛可能会引起局部组织的肿胀。研究表明，白细胞毒素具有较好的免疫原性和免疫保护力[8]。本次试验所用疫苗在菌体抗原中增加白细胞毒素作为靶抗原，免疫后1～2d的体温升高及局部肿胀与白细胞毒素的作用有关。跟踪监测发现，免疫犊牛出现的体温升高和局部肿胀分别在免疫后5d及免疫后2周内完全恢复正常，且不影响其精神状况及正常的采食饮水，约有5%的牛需要关注，个别体温升高的犊牛可能需要使用非甾体抗炎药。综合评估，溶血曼氏杆菌灭活疫苗（A1型M164株）安全性良好。

疫苗免疫后血清抗体效价消长规律是评价疫苗效果的重要依据。4～6月龄犊牛及育成牛是溶血曼氏杆菌性肺炎的高发阶段，因此建议犊牛在2～3月龄时启动免疫。本次试验2月龄犊牛在完成二次免疫后14d抗体效价达到最高，免疫后6个月开始下降，此时平均效价为1:23，仅有45%的牛可提供有效保护，因此建议在二次免疫后5个月后再次加强免疫，以维持疫苗的有效性。如首免月龄推迟至3月龄，疫苗保护力可维持6个月。牧场可根据犊牛集中发病月龄，前推2个月作为首次免疫时间。

所有血清型的曼氏杆菌菌株在对数生长期均能分泌白细胞毒素，白细胞毒素是溶血曼氏杆菌的主要致病因子[9]。对于溶血曼氏杆菌，单纯的菌体疫苗对牛的保护存在不确定性，白细胞毒素可明显提高自然暴露牛对该病的抵抗力[10,11]。利用白细胞毒素制成的疫苗可刺激宿主的免疫系统产生中和抗体，同时可抵抗呼吸道溶血曼氏杆菌的攻毒[2]。对比研究发现，白细胞毒素与培养液上清混合制备的联合疫苗相比较于单独的白细胞毒素抗原以及菌体抗原都具有更好的保护力[8]，成为目前疫苗研制的主要方向。国内研发的牛曼氏杆菌病灭活疫苗（A1型M164株）是由曼氏杆菌菌体及白细胞毒素，经甲醛溶液灭活后，加入新型水佐剂混合而成。试验结果表明，牛曼氏杆菌病灭活疫苗（A1型M164株）的临床应用免疫原性较好，免疫后犊牛鼻咽拭子及肺组织中未检出牛溶血曼氏杆菌，能够有效预防因牛溶血曼氏杆菌造成的呼吸系统疾病。

4 结论

2～6月龄犊牛使用国产牛曼氏杆菌病灭活疫苗（A1型M164株）免疫后，未发生严重过敏反应。犊牛免疫后5d内出现体温升高及注射部位局部肿胀，可自行恢复，无其他不良反应。2月龄犊牛首次免疫，间隔21d后加强免疫，可提供有效保护抗体，建议在二免后5个月加强免疫。