聚赖氨酸/细菌纤维素抗菌敷料对烫伤大鼠创面菌群、胶质细胞活性及TGFβ1 蛋白的影响

王成枫，王金海

（1.福建中医药大学附属人民医院，福建 福州，350004；2.福建卫生职业技术学院药学系，福建 福州，350028）

皮肤组织是人体面积最大的器官，对人体有着非常重要的保护作用。烫伤是临床治疗及日常生活中较为常见的意外伤害，多由光、电、热等高温液体/固体/蒸气等导致的人体皮肤、黏膜、皮下组织等遭到破坏。现阶段，对于烫伤的处理措施主要以抗菌、消炎等药物进行干预。聚赖氨酸（Poly-L-Lysine，PLL）作为一类天然的微生物代谢产物，形态表现为淡黄/白色粉末，溶于水，具有广谱抑菌性，可对病原体、革兰氏阳性/阴性菌、真菌等产生抑制效能，目前，许多研究也将聚赖氨酸应用于医药等领域。细菌纤维素又为细菌纳米纤维素（Bacterial Nano-Cellulose，BNC），是经木醋杆菌等微生物分泌形成的天然高分子葡聚糖，具有纤维素的结构与化学性质[1]。BNC和植物或海藻产生的纤维素在化学性质上是相同的，均是经β-D-葡萄糖通过β-1,4-葡萄苷键结合成的直链，而其作为一种新型生物材料，具有较高的弹性模量、水结合性、生物适应性以及可降解性[2-6]。溶菌酶作为可存在于微生物细胞壁的一类水解酶，是体内重要的非特异体液免疫因子，又称细胞壁溶解酶，广泛存在于机体组织、体液和分泌物内，也是构成机体表面多种防御因素之一，具有一定的抗炎和抗免疫功能[7]。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)为分泌型蛋白，由神经胶质细胞合成分泌,并在中枢与外周神经胶质细胞外以及外周皮肤组织中均有所表达，影响组织重建[8]。在烫伤创口愈合过程中，生长因子可参与其调控的整个过程，而在众多肽类生长因子中，转化生长因子β1(TGFβ1)对创伤愈合具有较明显的干预作用[9]。本文通过对大鼠进行烫伤实验，讨论PLL/BNC对其皮肤创伤愈合的作用，并分别从创面菌群、胶质细胞活性及TGFβ1蛋白的影响等来揭示其在烫伤治疗中的作用机理，意在为聚赖氨酸/细菌纤维素抗菌敷料的开发及临床应用提供更多技术支持。

1.材料与方法

1.1 实验大鼠

选取SPF级健康成年雄性SD大鼠40只，周龄10～12，体质量为180-250g，购于上海斯莱克实验动物公司，许可证号：SYXK(闽)2018-035中进行，本动物实验均在福建卫生职业技术学院实验中心进行。

1.2 药物、试剂与仪器

ε-聚赖氨酸（南京轩凯生物科技有限公司）,细菌纤维素由本实验室制备,皮肤创面无机诱导活性敷料（深圳市华生元基因工程发展有限公司，批准文号：100126），戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：30037517），0.9%生理盐水、柠檬酸缓冲液（山东威高股份有限公司,批号1207121、1901025），苏木素-伊红（福建中医药大学医学实验中心），一抗I、Ⅱ型胶原蛋白抗体（美国，Abcam），山羊抗鼠 GFAP 抗体(Santa Cruz 公司)，蛋白定量试剂盒（美国Bio-Rad公司），切片机（上海医用仪器厂），显微镜（德国，Leica DMI 4000B/DFC425C）。

1.3 分组、模型建立

40只大鼠随机分为健康组、烫伤组、PLL/BNC组、药物对照组，平均每组10只。除10只健康大鼠外其余均依据文献[10]建立烫伤动物模型。将大鼠用40mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉后四肢展开取仰卧位，将小鼠背部皮肤毛发剔除，蘸取质量分数8%的硫化钠溶液，均匀涂抹在剃毛处，将该部位擦拭干净并暴露皮肤，把2cm直径的空心塑料管立在大鼠剃毛后位置，将管与皮肤进行密切接触，在管内灌入约为100℃的沸水，位于管高1/3位置，沸水管与皮肤接触20s后结束，此时大鼠皮肤即形成了直径约2cm且深Ⅱ度的烫伤区，且每只大鼠背部均在相同建立烫伤区。

1.4 PLL/BNC 抗菌敷料制备

依据文献[11]将制备的BNC膜片在100mL浓度为(0、0.5%、1.0%)的PLL溶液中进行浸泡，并将其放进超声清洗器中进行超声震荡，将聚赖氨酸与细菌纤维素均匀融合并充分吸附，时间为1h,进行3次重复震荡，每次时间间隔为为10min，并将吸附后的膜片浸泡在15%甘油内，3s后将其取出,将表面残余液体晾干，于烘箱中进行烘干，直至恒重，完成后以备后续实验。

1.5 给药

造模结束后，所有大鼠于建模后第2天开始治疗。将大鼠创面周围用生理盐水清洁擦干后，烫伤组大鼠用0.9%氯化钠溶液清洗创面后用0.5%的碘伏消毒创面，用2层0.9%氯化钠溶液纱布外敷包扎；药物对照组用0.9%氯化钠溶液清洗创面后使用0.5%碘伏消毒，将皮肤创面无机诱导活性敷料软膏均匀涂敷在创面，厚度约2mm，最后以无菌纱布包扎；PLL/BNC组采用以上方法消毒处理后，采用聚赖氨酸/细菌纤维素抗菌敷料进行干预，将其敷于创口处，于每日更换一次，均连续干预14d。

1.6 方法与检测

1.6.1 创面溶菌酶测定

依据文献[12]分别于治疗后第7d和第14d用注射器吸取生理盐水1mL，反复冲洗创口分泌3次，收集冲洗液并注入试管中，以3000×g离心15min，取下20μL沉液，注入含菌琼脂平板加样小孔内，于37℃恒温箱内观察结果，测量小孔周围溶菌环直径，代入回归方程计算出创面分泌物中含溶菌酶量。

1.6.2 创面愈合观察

观察各组大鼠治疗7 d、14 d 后的创面愈合率，烫伤面积计算通过Meeh’s公式计算体表面积(Acm2)=K×W2/3，W体重(g)，K=10，烫伤部位体表面积(B)=π×r1×r2cm (r1：短轴半径，r2：长轴半径)，实际的烫伤面积=B/A，并依据损伤剩余面积计算创面愈合率=(损伤总面积-创面剩余面积)/总面积×100%

1.6.3 HE 染色

麻醉处死大鼠后，取大鼠创伤处皮肤，保留皮下组织，于生理盐水中清洗后，平铺于滤纸上，在固定液中固定24h，完成后，将组织修剪为0.5cm×0.5cm×0.2cm方块，于包埋框中流水将固定液进行冲洗，脱水、透明、浸蜡，标本经脱水、常规石蜡包埋切片后，HE染色，二甲苯处理，中性树胶封固，在显微镜下观察皮肤组织变化。

1.6.4 免疫组化法检测星形胶质细胞标志物胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)

干预14d后，经腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉后,取创伤处皮肤及皮下组织,固定12h，加含20%蔗糖的磷酸缓冲液4℃过夜，沉淀后冷冻、切片20μm，漂片法在0.01mol/LPBS缓冲液中染色，切片置于0.25%TritonX-100溶液中，37℃温箱孵育30min，兔抗大鼠GDNF一抗4℃孵育48h，加生物素化羊抗兔IgG二抗及过氧化物酶标记的链霉卵白素37℃孵育30min，均以0.01mol/LPBS洗涤3次,5min/次，二氨基联苯胺显色，裱片在涂有明胶的载玻片上，脱水、透明、封片，每组随机选20张进行图像分析,检测GDNF阳性细胞的平均光密度与阳性面积百分比。

1.6.5 Western-blotting 检测转化生长因子β1(TGFβ1)、I 型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白

取大鼠皮肤组织剪碎后预冷，PBS洗涤后加入300uL的RIPA裂解液，于匀浆器中研磨裂解，冰浴中静置20min后，在4℃、14000r/min下离心15min，取上清液至离心管中，依据BCA蛋白定量说明测定蛋白浓度，蛋白调整浓度后，电泳，条件为浓缩胶80V，分离胶120V，后进行转膜，终止后PBS冲洗5min，丽春红染膜并观察，PBS冲洗，封闭液封闭1h，，加入稀释的一抗I型胶原蛋白(1:5000)、Ⅱ型胶原蛋白(1:2000)、TGFβ1（1:1500）,4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，加入稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5000），孵育1h后PBS洗涤，ECL化学发光试剂盒曝光显影，计算与β-actin及蛋白的相对表达含量。

1.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，组间比较采用独立样本t检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组创面分泌物溶菌环直径和溶菌酶含量表达

健康组皮肤组织良好；烫伤组大鼠在治疗后7d、14d溶菌环直径和溶菌酶含量均较低（P＜0.05）；与烫伤组大鼠比较，药物对照组大鼠在治疗后7d、14d溶菌环直径和溶菌酶含量均升高（P＜0.05）；与药物对照组比较，PLL/BNC组大鼠在治疗后7d、14d溶菌环直径和溶菌酶含量均升高（P＜0.05），见表1。

表1 各组创面分泌物溶菌环直径和溶菌酶含量表达（）

表1 各组创面分泌物溶菌环直径和溶菌酶含量表达（）

注：与烫伤组比较bP＜0.05；与药物对照组比较cP＜0.05。

2.2 各组大鼠创面愈合表达

与烫伤组比较，药物对照组大鼠在治疗后7d和治疗后14d的创面愈合表达均增加（P＜0.05）；与药物对照组比较，PLL/BNC组大鼠治疗后7d和治疗后14d的创面愈合表达增加（P＜0.05），见表2图1。

图1 创面愈合情况

表2 各组大鼠创面愈合表达（，%）

表2 各组大鼠创面愈合表达（，%）

注：与烫伤组比较bP＜0.05；与药物对照组比较cP＜0.05

2.3 HE 染色

健康组大鼠皮肤组织良好，无损伤状况；烫伤组坏死细胞较多，细胞排列紊乱，表层及毛囊坏死，血管扩张，炎症细胞浸润严重；药物对照组血管部分增多，仍有坏死细胞及毛囊坏死；PLL/BNC组新生血管明显增多，血管密度增大，且细胞排列较药物对照组整齐，见图2。

2.4 各组大鼠皮肤组织中GDNF 阳性细胞表达

与健康组比较，烫伤组大鼠GDNF阳性细胞平均光密度、阳性面积均升高（P＜0.05）；与烫伤组比较，药物对照组大鼠GDNF阳性细胞平均光密度、阳性面积均降低（P＜0.05）；与药物对照组比较，PLL/BNC组大鼠GDNF阳性细胞平均光密度、阳性面积均降低（P＜0.05），见表3图2。

表3 各组大鼠皮肤组织中GDNF 阳性细胞表达（，%）

表3 各组大鼠皮肤组织中GDNF 阳性细胞表达（，%）

注：与健康组比较aP＜0.05；与烫伤组比较bP＜0.05；与药物对照组比较cP＜0.05

图2 HE 染色(苏木精-伊红染色×200)

图2 免疫组织化学染色(×200)

2.5 各组大鼠皮肤组织中TGFβ1 及I 型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白表达

与健康组比较，模型组大鼠皮肤组织中TGFβ1、I型、Ⅱ型胶原蛋白降低（P＜0.05）；与烫伤组比较，药物对照组大鼠TGFβ1、I型、Ⅱ型胶原蛋白升高（P＜0.05）；与药物对照组比较，PLL/BNC组大鼠TGFβ1、I型、Ⅱ型胶原蛋白升高（P＜0.05），见表4图3。

表4 各组大鼠皮肤组织中TGFβ1、Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白表达（）

表4 各组大鼠皮肤组织中TGFβ1、Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白表达（）

注：与健康组比较aP＜0.05；与烫伤组比较bP＜0.05；与药物对照组比较cP＜0.05

图3 TGFβ1 及Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白表达

3 讨论

烫伤产生不仅可使皮肤造成创伤，还可造成机体皮肤软组织部分缺损，并伴随创面临污染及感染等危险。因此，进行有效的创面清理、药物治疗及创面修复是现阶段烫伤救治的关键。

溶菌酶可同时存在于嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞中，是关键的非特异体液免疫因子，且在机体正常防御及非特异免疫反应中均有所表现，其含量增加能够使大量抗体、补体、灭菌因子、纤维素等增加，进而有利于炎症消除和组织重建，加快创面愈合[13]。本文研究显示，PLL/BNC组大鼠在治疗后7d、14d溶菌环直径和溶菌酶含量均有所升高，并优于同期治疗的药物对照组。当烫伤产生时局部凝血会发生障碍，导致机体炎症反应出现，并伴随细胞增殖、细胞外基质合成及重塑发生障碍，使溶菌酶的正常防御和非特异免疫遭到破坏，进而导致创伤处伴随组织缺损性损伤。赖氨酸是机体中极其重要的氨基酸，能够被机体合成组织所需的蛋白质并参与代谢反应，而PLL有着较高的抗菌性能，对多种革兰氏阳性/阴性菌、真菌及病原体产生调控作用[14]。BNC作为一种优良的敷料基材，具有高纯度、高持水性、高力学性能以及良好生物相容性等多项优点。BNC利于皮肤组织良好生长和限制感染。有学者在研究中发现，添加细菌纤维素对部分细菌生长具有显著抑制作用[15]。同时，朱鸿伟等人在ε-聚赖氨酸及溶菌酶抑菌剂的开发及应用研究中发现，PLL与溶菌酶相协调可抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等产生[16]。本文研究与之结果相类似。由此推测，在烫伤中进行PLL/BNC处理可能通过促进改善烫伤皮肤患处有益菌的形成，并通过增进再上皮化，提高机体防御功能，进而改善及新生血管重建，提高创面愈合时间及愈合质量。

烫伤中创面愈合的关键病理机制为，创伤处局部组织和周围细胞的免疫功能降低，致使炎症发生反复性，最终导致创面表皮修复困难，影响疾病进程。本文研究显示，PLL/BNC组大鼠治疗后7d、14d的创面愈合率增加，并优于同期治疗的药物对照组。当烫伤产生时，常形成创面组织水肿、皮肤充血及局部皮肤组织损伤现象，因此，在治疗时应以降低感染率、维持创面稳定、降低皮肤坏死概率为研究重点。

经研究，BNC因其有良好的超细纳米纤维多孔构造，在透气、透水、吸湿以及阻挡外界微生物感染等方面具有较高的安全性，也因其具有较强的机械度在对创面包扎时通过适当施压可提高渗液引流，进而消除水肿，促进创面愈合[17-18]。有学者在研究中发现，有PLL参与的复合物制备有望作为理想的医用敷料，在慢性伤口护理、伤口感染治疗和伤口愈合过程中具有极其重要意义[19]。由此推测，PLL/BNC在烫伤中可能通过改善创面微环境，发挥其对创面消炎杀菌的效用，在防止创面细菌滋生引发感染及创面粘连的同时，加速肉芽生长、促进表皮形成提高创面愈合。

星形胶质是中枢神经系统内数量最多的一种胶质细胞，而GDNF作为胶质细胞的关键因子具有神经营养作用。本文研究发现，PLL/BNC组大鼠的GDNF阳性细胞平均光密度、阳性面积降低较显著，并优于同期治疗的药物对照组。当烫伤发生时，胞浆内含有的胶质原纤维GFAP在这一过程中可发挥调控作用。GFAP可使增生的星形胶质细胞在释放轴突再生抑制因子的同时重构了干扰髓鞘和轴索的再生，进而参与组织修复进程。PLL作为阳离子杀菌剂，对细菌细胞膜和动物细胞膜具有高度的选择性，在质量浓度为2mg/mL时对人真皮成纤维细胞无毒性，且生物相容性佳[20]。而BNC可通过增加毛细血管和成纤维细胞减轻创面炎症、促进创面闭合及肉芽组织形成、增强胶原沉积及血管生成，使创伤组织加速完成修复[21]。Liu S等人在研究中表示，PLL能够与静电产生反应，吸附到细菌表面，并通过打破细胞壁和细胞膜的整体性使内容物外渗、杀灭细菌，过程中可通过调节星形胶质细胞活性从而促进创面愈合[22]。由此推测，PLL/BNC在烫伤治疗中，可能通过干预胶质细胞内GDNF合成与分解，在发挥降低局部炎症皮肤及皮下组织的同时调节GDNF免疫反应阳性细胞,并通过参与创面修复，进而发挥烫伤皮肤组织保护作用。

I型和Ⅱ型胶原蛋白作为皮肤组成的关键因素，对烫伤后的创面愈合具有极其重要意义。TGFβ1作为细胞生长中的多功能调节因子，能够增进成纤维细胞与外基质的生长，诱导细胞因子释放，促进伤口愈合。本文研究中，PLL/BNC组大鼠TGFβ1、I型、Ⅱ型胶原蛋白升高较显著，并优于同期治疗的药物对照组。烫伤可在一定程度上造成创面皮肤中胶原沉积与创面收缩发生阻碍，导致TGF-β1向肌成纤维细胞转化困难，进而使得皮肤新生组织形成发生阻滞。BNC作为皮肤创面的活性敷料，能明显抑制细菌形成，对难愈合性创面具有显著有效性，可通过增加结缔组织、成纤维细胞及胶原蛋白含量改善创面损伤。PLL在创面产生杀菌作用的同时为组织修复提供良好环境，促进组织胶原蛋白在血管损伤中的修复和形成。庄兢等人在对皮肤损伤治疗中使用无机诱导活性敷料进行干预，发现其对难愈型皮肤损伤中相关胶原蛋白的合成具有良好促进效果[23]。提示，PLL/BNC可能在持续诱导细胞自身胶原蛋白与相关上皮生长因子结合的同时，使TGFβ1通过促进胶原的合成，诱导新生组织形成，提高创面愈合，加速创面愈合。

综上所述，聚赖氨酸/细菌纤维素抗菌敷料可对烫伤大鼠产生治疗效果，可显著抑制烫伤创面菌群，调节胶质细胞活性，研究研究与调节TGFβ1蛋白相关。但由于本次研究对于聚赖氨酸/细菌纤维素在胶质细胞中的研究及敷料的用量上仍存在一定不足，会在日后实验中通过扩大样本量进一步使其完善。