魔芋葡甘聚糖/表面脱乙酰甲壳素纳米纤维复合凝胶的制备及流变性能

姜海鑫，黄叶群，郑萍云，赵建波，段孟霞，庞 杰，吴春华

（福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002）

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）是一种主链由-甘露糖和-葡萄糖组成，并以-1,4-糖苷键连接的高分子质量的中性多糖。KGM具有良好的持水性、凝胶性和生物相容性等特点，可用于开发大量的产品，如食品中的无糖魔芋软糖、魔芋豆腐、果冻丁和魔芋仿生食品等，具有广阔的市场前景。然而，仅用KGM制备的凝胶存在凝胶弹性低、析水率高和赋色难等缺点，极大地限制其在食品工业中广泛应用。近年来，通过添加其他天然多糖改善KGM复合凝胶性能已成为食品领域研究的热点之一。

表面脱乙酰甲壳素纳米纤维（surface deacetylated chitin nanofiber，S-ChNF）是一种从食品加工副产物甲壳素分离出的具有纳米结构的新型食品原料。S-ChNF不仅保留了甲壳素原有的特性，还具有高比表面积、超精细结构及优异的力学强度、模量和乳化性等优点，被广泛应用于食品、化工及生物医药等领域。利用KGM与S-ChNF的协同或互补作用，有望赋予食品优良的口感、致密的组织结构、良好的持水性与稳定性，可用于开发凝胶剂、稳定剂和增稠剂。然而，目前尚未有KGM与S-ChNF相互作用的研究。

本实验以S-ChNF与KGM为研究对象，将两者按照一定质量比复配制得KGM/S-ChNF复合凝胶。通过旋转流变仪、扫描电镜、傅里叶变换红外光谱、X射线衍射图谱及热重分析对KGM/S-ChNF复合凝胶的性质和微观结构进行表征，以期为复合凝胶的性能优化提供必要的理论依据，为KGM/S-ChNF复合物在新型食品凝胶剂、食品包装和食品运载体系等方面的开发与应用提供相应的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

KGM（食品级，纯度≥95%） 云南昭通三艾有机魔芋发展有限责任公司；甲壳素 美国Sigma-Aldrich公司；乙酸、氢氧化钠、标准盐酸溶液、溴化钾（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AVATAR360型傅里叶变换红外光谱仪 美国Nicolet尼高力公司；MCR301型流变仪 奥地利Anton Paar有限公司；JY92-IIN型超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技有限公司；JSM-7500F型冷场发射扫描电子显微镜、JEOL 1010型透射电子显微镜 日本电子株式会社；D/MAX-RB型X射线衍射仪 日本理学电机公司；STA 409-PC热稳定分析仪 德国Netzsch公司。

1.3 方法

1.3.1 S-ChNF粉末制备

准确称取10 g甲壳素，置于250 mL质量分数33%的NaOH溶液中，再加入0.03 g硼氢化钠，置于90 ℃恒温水浴锅中磁力搅拌4 h。抽滤溶液，上层滤渣用蒸馏水清洗至不变色，置于45 ℃烘箱中烘至半干。用1%醋酸溶液（/）溶解粉末制备5 mg/mL悬浮液，使用超声波细胞粉碎机超声粉碎1 h，超声功率为100 W。悬浮液在8 000 r/min转速下离心20 min，取上清液冷冻干燥，得到S-ChNF粉末。

1.3.2 透射电子显微镜扫描

配制0.01 g/mL S-ChNF悬浮液，取20 μL悬浮液浸没碳涂层铜网。风干后用乙酸双氧铀染色20 min，室温干燥5 min。在加速电压80 kV条件下用透射电子显微镜观察S-ChNF样品。

1.3.3 酸碱滴定法测定脱乙酰度

分别称取一定质量S-ChNF和甲壳素（记为），转移至干燥洁净的称量皿中后，置于105 ℃烘箱中烘至质量恒定后，记录剩余质量为，计算水分质量分数（）：

分别准确称量0.2 g S-ChNF和甲壳素，溶解于25 mL 0.1 mol/L HCl溶液中，滴加2～3 滴甲基橙指示剂，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至溶液变为橙色。计算脱乙酰度：

式中：为S-ChNF或甲壳素质量/g；为S-ChNF水分质量分数/%；为HCl溶液浓度/（mol/L）；为HCl溶液体积/mL；为NaOH溶液浓度/（mol/L）；为NaOH溶液体积/mL；0.016为与1 mL 1 mol/L HCl溶液相当的氨基质量/g；9.94%为理论氨基的含量。

1.3.4 KGM凝胶、KGM/S-ChNF复合凝胶及凝胶冻干样品制备

称取一定质量的S-ChNF和KGM粉末，分别得到4 份不同混合比例的KGM/S-ChNF粉末（总质量为1.5 g），S-ChNF质量分数分别为0%、10%、15%、20%。将98.5 g去离子水加入装有KGM/S-ChNF粉末的烧杯，室温下搅拌。将烧杯置于60 ℃恒温水浴锅，用转速为650 r/min的机械搅拌器混匀120 min，制得KGM凝胶和KGM/S-ChNF复合凝胶备用。在测定前复合凝胶需做溶胀处理，溶胀时间为2 h。流变特性分析可直接使用溶胀后的凝胶，其余实验应在凝胶静置、冷却并处于凝胶状态后进行。

称取50 g KGM/S-ChNF复合凝胶于培养皿中，置于－20 ℃的冰箱预冻24 h。包上已扎好均匀孔洞的保鲜膜，继续进行24 h的冷冻干燥，得到凝胶冻干样品。

1.3.5 凝胶流变特性测定

用流变仪对制得的凝胶样品进行流变性能测定。流变仪平板探头为PP50型号，平板间距设置为1.0 mm。

1.3.5.1 凝胶静态流变学特性测定

在温度（25±1）℃、剪切速率0.01～100 s条件下，测定KGM凝胶及不同混合比例的KGM/S-ChNF复合凝胶的黏度与剪切速率间的关系。

对各凝胶的剪切速率与黏度的关系曲线进行拟合分析，所用模型为幂律模型：

式中：为剪切应力/Pa；为稠度系数/（Pa·s）；为剪切速率/s；为流动指数。

1.3.5.2 动态黏弹性测定

在温度（25±1）℃、应变5（线性黏弹区范围内）、角频率0.1～20 s条件下进行角频率扫描，得到KGM凝胶及KGM/S-ChNF复合凝胶的储能模量（’）、损耗模量（”）及复合黏度（*）随角频率的变化曲线。

在频率为1 Hz、应变为5（线性黏弹区范围内）、温度为25～65 ℃的条件下，以5 ℃/min升温速度进行扫描，得到KGM凝胶及KGM/S-ChNF复合凝胶’和”随温度的变化曲线。

1.3.6 扫描电子显微镜分析

取少量KGM凝胶及KGM/S-ChNF复合凝胶冻干样品，对其充分喷洒金粉，放置20 min后在放大倍率为1 000 倍、最大加速电压为20 kV的条件下进行电镜扫描，得到电镜扫描图，观察其表面形态。

1.3.7 傅里叶变换红外吸收光谱分析

将KGM/S-ChNF复合凝胶真空冷冻干燥48 h后。分别称取5 mg甲壳素、S-ChNF、KGM凝胶及KGM/S-ChNF复合凝胶冻干样品剪碎，按1∶99（/）分别与溴化钾颗粒混合研磨、压片。采用傅里叶变换红外光谱仪对压片样品进行分析，扫描范围400～4 000 cm。

1.3.8 X射线衍射分析

用X射线衍射仪测定扫描角度为5°～50°的甲壳素、S-ChNF、KGM凝胶及KGM/S-ChNF复合凝胶的结晶状态。

1.3.9 热稳定性分析

在25～600 ℃，采用热稳定分析仪对KGM凝胶及KGM/S-ChNF复合凝胶冻干样品进行热稳定性分析。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 S-ChNF及甲壳素表征分析

图1 甲壳素和S-ChNF的傅里叶变换红外光谱图（a）、X射线衍射图谱（b）及S-ChNF的透射电子显微镜图（c）Fig. 1 FTIR spectra (a), X-ray diffraction patterns (b) and transmission electron micrographs (c) of chitin and S-ChNF

经NaOH溶液处理后甲壳素脱乙酰度由（5±1）%升高至（39±2）%，表明大部分乙酰基团被脱除。如图1a所示，甲壳素与S-ChNF的红外吸收光谱图差异明显，这主要归因于脱乙酰度的变化。甲壳素的特征吸收峰主要位于3 440 cm的O—H键的拉伸振动以及位于3 240 cm处的N—H键拉伸振动。此外，位于1 660 cm和1 620 cm处的特征峰代表了甲壳素的酰胺I带，位于1 550 cm处的特征峰代表了甲壳素的酰胺II带，位于1 310 cm处的特征峰代表了甲壳素的酰胺Ⅲ带。相较于甲壳素，S-ChNF光谱图中代表酰胺基团的各个特征峰（位于1 660、1 620、1 310 cm波数处）的透过率明显降低，表明S-ChNF中大部分酰胺基团被脱除，从而转变为氨基，对应了脱乙酰度的改变。如图1b所示，甲壳素与S-ChNF的衍射角2在9.3°及19.3°处均有明显的特征峰，且分别代表了甲壳素晶体结构的（020）面和（110）面。除此之外，甲壳素的衍射角在23.3°、26.4°、29.4°等位置均存在特征峰，而S-ChNF的衍射角则在28.4°、31.7°等位置存在特征峰，此结果显示了甲壳素与S-ChNF的晶体结构并未发生明显变化，仅仅产生了特征峰偏移现象，说明脱乙酰作用只发生在晶体表面，并未破坏其结构。由图1c可知，所制备的S-ChNF形貌呈现细长的纤维状。

2.2 KGM/S-ChNF复合凝胶静态剪切特性分析

如图2所示，所有KGM/S-ChNF复合凝胶的黏度表现出随着剪切速率的提高先小幅度提升后逐渐降低的趋势，呈现出了剪切稀化的现象，是假塑性流体的典型特征。这主要是由于不断提高的剪切力作用于复合凝胶后产生的导向行为。随着剪切速率的升高，剪切应力逐渐提高，KGM和S-ChNF分子链间的相互作用力被不断削弱，使得复合体系内的自由大分子链从杂乱无序的随机流动状态变为趋于一致的沿剪切力方向的均匀流动状态，相互作用的分子链间的间隙被拉大，氢键等相互作用力逐渐降低，从而导致复合凝胶的黏度降低呈现出“剪切稀化”的现象。此外，在低剪切速率的条件下，所有复合凝胶黏度小幅度上升的现象可以解释为当复合凝胶体系受到较小的剪切力作用时，KGM分子链以及S-ChNF之间相互作用产生的缠结结构会阻碍沿剪切应力方向的位移，从而提高黏度。对图2中流变曲线进行幂律方程拟合分析，越小，凝胶流体的假塑性程度越大。由表1可知，幂律方程拟合的均大于0.99，说明此拟合模型准确。随着S-ChNF添加量的增加，凝胶的黏度增加（图2），剪切应力降低，由23.174 Pa·s（KGM）增大至29.950 Pa·s（KGM/S-ChNF15），由0.436 63（KGM）降低至0.413 08（KGM/S-ChNF15），此结果再次佐证了上述KGM/S-ChNF复合凝胶均为非牛顿假塑性流体。

由图2可知，随着剪切速率的不断增大，不同KGM/S-ChNF复合凝胶的黏度明显减小且黏度差异逐渐缩小并趋于重合，这是因为不同质量分数的复合凝胶体系中形成氢键作用力均被高剪切力破坏，从而降低氢键对复合凝胶体系的黏度增强的差异。这些相似的流动特性在其他多糖中也有相关发现。还可看出，S-ChNF的不同添加量均对凝胶黏度产生积极影响，在相同剪切速率的条件下，KGM/S-ChNF复合凝胶体系的黏度始终高于纯KGM凝胶，说明S-ChNF的加入能够明显提高凝胶的黏度，使得体系结构更稳定有序。

图2 KGM和KGM/S-ChNF凝胶的黏度-剪切速率关系曲线Fig. 2 Viscosity versus shear rate curves of KGM and KGM/S-ChNF gels

表1 各凝胶静态流变特性的拟合分析Table 1 Fitting parameters for static rheological properties of different gels

2.3 KGM/S-ChNF复合凝胶的动态流变学性能分析

2.3.1 KGM/S-ChNF复合凝胶动态频率扫描分析

由图3可知，4 组不同复配比例凝胶的频率扫描曲线均表现出随着角频率的提高，’与”逐渐上升，而*呈下降的趋势。然而，S-ChNF的不同添加量会导致凝胶的流变学性能产生较大的差异。*随着S-ChNF添加量的增加而逐渐增大，这可能因为一方面S-ChNF含量的增多，使单位体积内的分子链增多，能够产生更多分子缠结；另一方面KGM与S-ChNF之间产生了更多的氢键作用力，增强了复合凝胶的结构，从而导致*上升。由图3可知，所有曲线在较低角频率下均表现出’＜”的现象，此时体系表现为黏性凝胶流体；而随着角频率的提高，则会出现’＞”的现象，表明此时凝胶体系的弹性趋势大于黏性趋势，从而表现出凝胶的弹性特征。此外，’与”之间存在一个交叉点，当S-ChNF的添加量为10%（图3b）、15%（图3c）和20%（图3d）时，交叉点出现时角频率分别为6.77、4.76、3.77 s，交叉点向低角频率方向移动，表明分子间氢键作用力强，增大了KGM分子链移动的阻力，松弛时间变长，凝胶倾向于呈现弹性特征。

图3 KGM（a）、KGM/S-ChNF10（b）、KGM/S-ChNF15（c）、KGM/S-ChNF20（d）凝胶的黏弹性-角频率关系曲线Fig. 3 Viscoelastic versus angular frequency curves of KGM (a),KGM/S-CHNF10 (b), KGM/S-CHNF15 (c) and KGM/S-CHNF20 (d) gels

2.3.2 温度对KGM/S-ChNF复合凝胶黏弹性的影响

从图4看出，添加S-ChNF后，凝胶的’和”提高，这表明加入S-ChNF能促进KGM形成更稳定的空间网络结构，且二者的相互作用表现出协同作用。在25～60 ℃中，KGM凝胶的”在整个升温过程中始终高于’，凝胶的弹性较差，表明KGM凝胶对热敏感，凝胶体系的网络结构极易遭受破坏。此外，从图4还能观察到每个KGM/S-ChNF复合凝胶的’和”都存在一个交叉点，与纯KGM凝胶的交叉点相比，复合凝胶的交叉点向右偏移，表明凝胶耐热性得到了提升。同时，在交叉点的温度时，凝胶体系开始从凝胶态转向溶胶态；在交叉点左侧，即温度较低时（’＞”），凝胶体系中弹性成分主导，具有较强凝胶性；在交叉点右侧，即温度较高时（’＜”），凝胶体系中黏性成分主导，凝胶融化；这主要是因为温度升高，分子所受到的布朗运动加剧，凝胶体系中维持结构的氢键被破坏，导致’和”均显著降低，复合凝胶也从凝胶态转向溶胶态。因此，动态流变性能分析表明在KGM凝胶中添加适量添加S-ChNF，能有效提高KGM的黏弹性以及耐热性。同时，也可利用这一性质，来开发新型的凝胶稳定剂。这为KGM/S-ChNF复合凝胶体系应用到各领域提供理论依据，为KGM/S-ChNF复合凝胶产品技术在更多工业领域的应用提供了可能，从而满足更多生产技术和消费者的需求。

图4 KGM和KGM/S-ChNF凝胶的黏弹性-温度关系曲线Fig. 4 Viscoelastic versus temperature relationship of KGM and KGM/S-CHNF gels

2.4 KGM/S-ChNF复合凝胶扫描电镜分析

从图5可知，KGM凝胶、KGM/S-ChNF10复合凝胶、KGM/S-ChNF15复合凝胶的内部形貌差异明显。纯KGM凝胶整体结构松散空洞、存在大量大小不规则的孔隙，且孔隙仅以纤维须状物连接，极易受力变形；然而，随着S-ChNF的加入，复合水凝胶内部形貌得到有限改善，可观察到凝胶内部的平均孔隙缩小、纤维须状物减少。尤其是KGM/S-ChNF15复合凝胶内部孔隙大小规则、纤维须状物较少。这表明KGM与S-ChNF之间的相互作用力能够维持稳定的网状结构，S-ChNF能够增强KGM凝胶的稳定性并很好地改良KGM凝胶的凝胶强度。

图5 KGM（a）、KGM/S-ChNF10（b）和KGM/S-ChNF15（c）凝胶的扫描电子显微镜图Fig. 5 SEM images of KGM (a), KGM/S-ChNF10 (b) and KGM/S-ChNF15 (c) composite gels

2.5 KGM/S-ChNF复合凝胶红外光谱分析

图6 KGM和KGM/S-ChNF凝胶的红外光谱图（a）及氢键可能的作用机制图（b）Fig. 6 FTIR spectra (a) of KGM and KGM/S-ChNF gels and possible mechanism of hydrogen bonding (b)

由KGM/S-ChNF复合凝胶的红外光谱图（图6a）可知，对于纯KGM凝胶曲线中，位于3 415、1 727 cm处的尖锐吸收峰，分别代表了O—H伸缩振动以及C＝O振动，是KGM凝胶的主要特征峰，说明KGM中含有大量的羟基和乙酰基等特征基团。相比于纯KGM凝胶在O—H伸缩振动吸收峰，KGM/S-ChNF复合水凝胶的O—H吸收峰峰域更宽，且吸收峰强度更强，这表明二者共混相互作用之后含有的羟基数量减少，主要以氢键形式吸收并包容大量的游离水。S-ChNF的添加使得复合凝胶出现了波长位于1 612、1 574 cm的两个新特征峰，这代表S-ChNF中氨基的N—H键的弯曲振动，是S-ChNF的主要特征峰，说明S-ChNF很好地填充在KGM的凝胶网络中。S-ChNF的添加引入了氨基，复合凝胶体系中存在更多N—H能够在分子间产生更多的氢键相互作用。1 630～1 640 cm为氢键的吸收峰范围。图6a可知，KGM凝胶的氢键吸收峰为1 638.4 cm，KGM/S-ChNF10、KGM/S-ChNF15、KGM/S-ChNF20复合凝胶氢键的吸收峰则分别是1 639.4、1 639.4、1 638.4 cm。推测复合凝胶中氢键的作用机制如图6b所示，KGM凝胶中随着S-ChNF的添加，分子间产生了更多的氢键相互作用力（KGM分子之间的氢键作用以及KGM与S-ChNF之间的氢键作用力），这些强氢键作用力维持了凝胶的网状结构。同时，作为纳米填料，S-ChNF的显著填充作用也能够提高复合凝胶的稳定性。此外，KGM/S-ChNF复合凝胶中O—H（3 411 cm）较KGM凝胶发生红移（图6a）。因此，S-ChNF与KGM共混过程中发生的协同作用，能够增强氢键相互作用，维持更稳定复合水凝胶网状结构，且复合凝胶具有更强的吸水性和保水性。

2.6 KGM/S-ChNF复合凝胶X射线衍射分析

如图7所示，KGM凝胶在衍射角2为21°时出现了一个弱峰，这说明KGM凝胶处于无定型状态，属于非晶态结构。而随着S-ChNF的加入，KGM/S-ChNF10、KGM/S-ChNF15复合凝胶的衍射特征峰分别在衍射角2为21°和23°处，KGM/S-ChNF15复合凝胶的衍射特征峰发生偏移。相较于纯KGM凝胶的衍射图谱，复合凝胶的峰面积增加，表明KGM与S-ChNF在体系中相容性很好，结构更稳定，结晶度降低。

图7 KGM/S-ChNF复合凝胶的X射线衍射图谱Fig. 7 X-ray diffraction patterns of KGM/S-ChNF composite gels

2.7 KGM/S-ChNF复合凝胶热稳定性分析

如图8所示，所有的凝胶样品热降解过程均可分为3 个阶段。第1阶段主要是水分的散失，25～100 ℃主要是凝胶内部水分的散失，150～200 ℃则主要与分子间水份散失有关。第2阶段主要是氢键的破坏以及多糖分子链的断裂，250～350 ℃质量损失最大，是热降解的主体过程。最后阶段的质量损失速率小，温度跨度较大，主要是多糖分子主链进一步热降解所致。当温度达到600 ℃时，复合凝胶的最终质量分数均高于纯KGM凝胶质量分数，说明S-ChNF的加入能够提高复合凝胶的热稳定性。值得注意的是，KGM/S-ChNF15复合凝胶在整个热降解过程中，质量损失速率明显低于其他凝胶，这说明在此配比下制备的复合凝胶具有更稳定的结构。

图8 KGM和KGM/S-ChNF凝胶的热重分析图Fig. 8 Thermogravimetric analysis of KGM and KGM/S-ChNF gels

3 结 论

以KGM和S-ChNF为实验原料，将二者共混制成复合凝胶，运用扫描电子显微镜、傅里叶变换红外光谱、X射线衍射图谱以及热重分析等方法对不同配比的KGM/S-ChNF复合凝胶的流变行为进行讨论。结果表明：KGM/S-ChNF复合凝胶是一种假塑性流体；S-ChNF的加入对复合凝胶的流变性能有明显改善，有利于优化和改善流体性能；KGM与S-ChNF存在相互作用，且体系中KGM起主导作用，随着S-ChNF含量的增加，两者间的相互作用增强，并在一定比例下使凝胶的空间网络结构变得更加稳定，从而使复合凝胶的稳定性提高；由扫描电子显微镜分析可知，S-ChNF和KGM彼此表现为良好的促进作用，使得复合凝胶体系的三维网状结构得到增强，且KGM凝胶各方面性能都得到有效的完善；由X射线衍射图谱分析可知，KGM和S-ChNF的相容性很好，混合之后结晶度降低；由热重分析可知，S-ChNF的添加能够有效提高复合凝胶的热稳定性。因此，上述结果表明S-ChNF能够提升KGM凝胶的整体性能。然而，本研究仅针对S-ChNF对KGM凝胶的性能影响进行研究，未来可以深入研究KGM/S-ChNF复合凝胶作为载体在食品工业及生物医药领域的应用。