腹泻仔猪的粪便微生物代谢组学分析

周心晨，王兰，张雨琛，韩新燕*

（1.海南浙江大学研究院，浙江大学动物科学学院，农业农村部华东动物营养与饲料重点实验室，浙江杭州 310058；2.海南农垦草畜猪业有限公司，海南海口 570100）

仔猪腹泻是养猪生产的一大难题，仔猪腹泻不仅会严重影响其成活率，还会持续影响后续的增重。在饲料全面禁抗的背景下，采用非药物手段维护仔猪肠道健康显得尤为重要。肠道菌群在动物的肠道健康中发挥着不可或缺的作用，它们能够影响宿主肠道发育、协同机体调节能量代谢。肠道菌群的代谢产物在肠道上皮细胞、肠道菌群和肠道免疫细胞组成的复杂系统中作为重要信号物质参与调节肠上皮屏障的功能的正常运行。腹泻仔猪的菌群代谢变化鲜有报道。因此，本研究旨在探讨腹泻仔猪粪便菌群结构及代谢差异，为进一步探究菌群与仔猪肠道之间的互作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验设计与饲养管理 动物和实验设计经浙江大学动物保护和使用委员会批准。本实验随机选取胎次相同的10 日龄左右的哺乳仔猪作为研究对象，按照猪场的正常免疫措施和管理模式进行饲养，分别随机采集腹泻（D）与非腹泻仔猪（H）的粪便作样本保存。

1.2 肠道菌群16S rRNA 测序 利用Thermo NanoDrop 2000 紫外微量分光光度计和1% 琼脂糖凝胶电泳进行总DNA 质检。提取出的肠道食糜微生物DNA 的16S rRNA 扩增选择区域为V3-V4 区，使用的通用引物为341F 和806R。在通用引物的5' 端加上适合Illumina Miseq PE250 测序的index 序列和接头序列，完成特异性引物的设计。Forward Primer（5'-3'）：CCTACGGGRSGCAGCAG（341F）；Reverse Primer（5'-3'）：GGACTACVVGGGTATCTAATC（806R）。以稀释后的基因组DNA 为模板，使用KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR kit 高保真酶进行PCR，确保扩增的准确性和高效性。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR 产物。回收后，利用Thermo NanoDrop 2000 紫外微量分光光度计和2%琼脂糖凝胶电泳进行文库质检。文库质检合格后，使用Qubit 进行文库定量，并根据每个样品的数据量要求，进行相应比例的混合。使用Illumina Miseq PE250 上机测序。

1.3 粪便LC-MS 代谢组学分析 取粪便样品100 mg 左右，加入10 倍体积的预冷90% 甲醇（即100 mg 样本加入1 mL 90%甲醇），匀浆，干燥。乙腈水溶液处理后取上清液进样分析。用Agilent 1290 Infinity LC 系统进行色谱分析，全程4℃自动进样。采用正、负离子双模式进行质谱鉴定。原始数据经ProteoWizard 转换成mzML 格式，然后经XCMS 和SIMCA-P 14.1 软件处理得到数据，数据经Pareto-scaling 预处理后，分别进行单维和多维统计分析。在 KEGG 数据库中匹配和聚类分析并用Java TreeView 软件绘图。Fisher 精确检验（Fisher's Exact Test）用于比较各通路在代谢物集合中的分布，评价通路代谢物富集的显著性。

1.4 统计分析 所有结果数据均用SPSS 25.0 统计软件处理，以平均数± 方差表示，以<0.05 为差异显著。各组间数据采用Duncan's 多重比较进行差异显著性检验。对微生物组数据进行Student's t 检验，使用Pearson 相关性分析生成肠道差异物种与耐药基因之间的相关矩阵，并利用Graphpad prism 作图。

2 结果

2.1 腹泻仔猪与非腹泻仔猪粪便菌群组成差异

2.1.1 腹泻与非腹泻组粪便菌群结构分析 如图1-A 所示，在门水平上，2 组所含主要菌门一致，拟杆菌门是腹泻猪和非腹泻猪中数量最多的，分别占比54.83%和54.36%，其次是厚壁菌门（在2 组中分别占42.78%和41.67%）。值得一提的是，梭杆菌门只有在腹泻组中被检测到但未在非腹泻组检测到。在属水平上（图1-B），普氏菌属（）是最丰富的菌属，在非腹泻组和腹泻组中分别占比54.57%和50.44%；其次是巨型球形菌属（），在非腹泻组和腹泻组中分别占13.08%和9.56%；第三为乳杆菌属（），在非腹泻组和腹泻组中分别占比为4.05%、7.84%。

图1 腹泻与非腹泻组粪便菌群结构分析

2.1.2 腹泻与非腹泻组粪便差异菌群及网络分析LEfSe 分析进一步检测出非腹泻组特有的3 个类群与腹泻组特有的22 个类群。如图2-A 所示，在科水平上，乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）、红杆菌科（Rhodoba cteraceae）和 Erysipelotrichaceae 在腹泻组菌群中的丰度显著低于非腹泻组。梭状芽孢杆菌（）乳酸杆菌（）、拟杆菌（）、等菌属的丰度也低于非腹泻组（<0.05）。而腹泻组中韦荣球氏菌（）、月形单胞菌（）和的丰度高于非腹泻组（<0.05）。为进一步探讨不同菌属间的相关性，通过计算各属间的Spearman 相关系数，对菌群进行相关性分析。从图2-B 中可以看出，非腹泻组的菌群相互作用程度较高，相关度最高的2 个属分别是梭状芽孢杆菌（）和（0.75）。韦荣球氏菌（）和呈负相关。由此可见，腹泻仔猪微生物群落之间的联系减弱，并且腹泻后显著增多的韦荣球氏菌（）可能和正常情况下的存在竞争关系。

图2 腹泻与非腹泻组粪便菌群结构分析

2.1.3 菌群功能分析 为探究腹泻组与非腹泻组菌群的功能变化，采用PICRUSt 法分析各样品中的微生物群，根据以上所获得的基因序列在KEGG 途径第3 层级预测菌群功能。结果如图3 所示，腹泻组脂多糖生物合成等途径的相关基因丰度比例升高（<0.05），精氨酸、组氨酸代谢等途径相关基因的相对丰度降低（<0.05）。

图3 腹泻与非腹泻组粪便菌群功能分析

2.2 腹泻仔猪与非腹泻仔猪粪便代谢组学差异

2.2.1 代谢数据质量评价 如图4-A、4-B 所示，2 组样本能够明显区分，反映组内样品聚类良好，组间样品分离良好。为避免建模过程中监督模型的过拟合，采用替代检验对模型进行检验，以保证模型的有效性。如图4-C和4-D 所示，随机模型的和Q随着替换保留量的逐渐减少而逐渐减小，说明原模型不存在过拟合现象，模型稳健性良好。

图4 代谢数据质量评价

2.2.2 差异代谢物生物信息学分析 以VI>1 和<0.05为条件，对鉴定的代谢物进行筛选，得到26 种差异代谢物（图5-A、5-B）。腹泻组相较非腹泻组来说，硫胺素（Thiamine）、吡哆醇（Pyridoxine）、糖精（Saccha rin）、Norharmane、Indole-2-Carboxylic Acid、N,N-Dimethylsphingosine、11（Z）,14（Z）-Eicosadienoic Acid、2-Oxoadipic Acid 共8 种代谢物显著上调；二甲基砜（Dimethyl SULFOne）、油酸（Oleic Acid）、壬二酸（Azelaic acid）、3-甲基二酸（3-Methyladipic acid）、石胆酸（Lithocholic acid）、肉豆蔻酸（Myristic acid）、MG（18:2（9Z,12Z）/0:0/0:0）[rac]、L-Palmitoylcarnitine、alpha-Tochopheryl Acetate、4-Hexen-1-ol,（E）、N-Palm itoylsphingosine、Cer（d18:1/18:1（9Z））、1-Palmitoylsn-Glycero-3-Phosphocholine、Tridecanoic Acid、4-Pyr idoxic Acid、3b-Hydroxy-5-Cholenoic Acid、20-HETE、Heptadecanoic Acid 共18 种代谢物显著下调，这些差异代谢物主要属于酮酸、脂肪酰基、吡啶、类固醇、磺胺、长链脂肪酸、脂质和类脂分子等。相关分析有助于测量代谢物之间代谢亲和力的程度，从而进一步理解代谢物在腹泻引起的生物状态变化过程中的调控关系。代谢物的网络关系如图5-C、5-D 所示，Tridecanoic Acid 等脂质和类脂分子间具有明显的正相关性，硫胺素与大多数差异代谢物呈负相关（如二甲基砜），有机酸2-Oxoadipic Acid 与大多数差异代谢物呈负相关（如Tridecanoic Acid）。

图5 差异代谢物生物信息学分析

2.2.3 代谢通路分析 对差异显著的代谢物的KEGG 通路注释结果如表1 所示，涉及到维生素B代谢、脂肪酸生物合成、硫传递系统、血管平滑肌收缩、硫胺代谢、味觉传导、硫代谢、维生素消化吸收、脂肪酸降解、赖氨酸降解、不饱和脂肪酸生物合成、花生四烯酸代谢、色氨酸代谢、胆汁分泌、脂肪酸代谢、氨基酸生物合成、2-氧羰基酸代谢、ABC 转运体、代谢途径共19 条代谢通路，差异显著的代谢途径主要与维生素B代谢、脂肪酸生物合成和硫传递系统有关。

表1 KEGG 注释到的代谢通路

3 讨 论

同人类儿童的情况类似，腹泻等胃肠道疾病是导致新生仔猪和断奶仔猪高发病率和高死亡率的主要原因之一，因此腹泻仔猪也被用作胃肠道细菌、真菌、原生生物或病毒感染的模型动物。通常认为，肠道微生物组失调是腹泻患者和腹泻动物的特征，病原体感染是腹泻表型的主要病因。合适的仔猪饲粮添加剂可以改善仔猪感染性腹泻，如仔猪饲料中添加鼠李糖乳杆菌可以调节肠道微生物菌群平衡，调控肠道免疫稳态，调节宿主营养物质代谢，改善仔猪腹泻，而芽孢杆菌混合物在治疗仔猪腹泻、帮助重建有益菌群方面极为有效，但其相关代谢组学和具体机制尚未得到充分研究。

梭杆菌门丰度显著升高是德国、俄罗斯、中国等各国急性阑尾炎患者的共同特征，胃肠道功能紊乱是阑尾炎的诱因之一；用大豆寡糖作为膳食补充剂添加到饲料中增加了仔猪肠道菌群多样性，并且显著降低了梭杆菌门的丰度。本实验中，梭杆菌门只有在腹泻组中被检测到，提示梭杆菌门数量增多与肠道功能紊乱有关。LEfSe 能判别物种对组间差异的影响程度。本实验LEfSe 分析显示，腹泻组等一些属的细菌数量增多。显著增加与PEDV感染仔猪粪便菌群生态失衡有关。与腹泻有关，当腹泻评分升高时，数量增加。本实验中这些和腹泻紧密联系的菌属增加提示腹泻仔猪的菌群存在生态失衡。研究表明乳酸杆菌能抑制病原弧菌等致病菌的生长，本研究中，腹泻组乳酸杆菌丰度降低，提示对病原菌的抑制作用减弱。之前的一项研究表明，梭状芽胞杆菌属在IBS 症状严重程度中起关键作用。本研究发现梭状芽胞杆菌是腹泻与非腹泻组之间的一个差异菌属且其数量与和呈负相关，表明腹泻仔猪的粪便微生物网络发生改变。脂多糖（LPS）的生物合成过程是细菌引起机体发病的机制的一个进程，在功能预测结果中发现，LPS 生物合成的升高可能与上述潜在致病菌的增加有关。

微生物组及其代谢物能够参与机体发育，影响宿主的免疫、代谢等多方面活动，因此又被称为机体的“第二基因组”。代谢组学能鉴定出细胞表达的分子物质并通过对其浓度的分析发现其对于环境变化的响应，如乳杆菌能通过在小鼠体内产生芳基烃受体配体来改善代谢综合征的特征。本实验在正负离子模式下总共检测到有机酸及其衍生物等 360 种代谢物，并筛选得到26 种具有显著差异的差异代谢物。硫胺素（维生素B），水溶性必需维生素，其缺乏会导致一系列疾病的发生。但是硫胺素过量会引起低活性精神错乱，导致营养依赖症，危重糖尿病患者的硫胺缺乏症与高乳糖血症之间也存在一定的关联。吡哆醇是维生素B的一种存在形式，参与能量代谢，维持免疫系统正常运转。吡哆醇过量也会引起一系列疾病，如加剧神经损伤、扰乱肠道屏障等。油酸已被证明可以刺激脂肪酸吸收、脂溶解和氧化，并促进食物摄入控制。与未处理的小鼠相比，双歧杆菌提高了小鼠胆汁中的石胆酸和熊去氧胆酸（UDCA），从而上调了回肠紧密连接蛋白的表达并降低了内毒素血症，从而降低了体重增加、高血糖和肝脏脂肪变性。在本实验中，腹泻组硫胺素、吡哆醇等物质含量上调，提示代谢紊乱，油酸、石胆酸等分子的下调也与肠道健康有着不可分割的关系。

4 结 论

本研究结果表明，腹泻仔猪粪便中乳酸杆菌科、红杆菌科、梭状芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、拟杆菌属等的丰度显著降低，韦荣球氏菌属、月形单胞菌属等的丰度显著增加；硫胺素、吡哆醇等差异代谢物上调，油酸、石胆酸等差异代谢物下调；富集到与维生素B、脂肪酸生物合成和硫传递系统代谢等相关的3 条差异代谢通路。提示，腹泻与肠道微生态失衡和菌群代谢紊乱息息相关。