哺乳动物DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3结构与功能的研究进展

王晨晨 张凡丽 陈珮琪 翁思瑶 王慧芳 崔小娟，2

（1.湖南科技大学生命科学与健康学院，湘潭 411201；2.湖南科技大学经济作物遗传改良与综合利用湖南省重点实验室，湘潭 411201）

DNA甲基化是表观遗传修饰的重要方式，在基因表达调控、基因组印迹、X染色体失活等事件中发挥了关键作用［1-4］。哺乳动物DNA甲基化主要由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）催化甲基从S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）转移至胞嘧啶第5位碳原子上。哺乳动物DNMTs家族成员主要包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和 DNMT3L， 其 中，DNMT1、DNMT3A和DNMT3B具有DNA甲基转移酶活性，因此，该综述主要针对DNMT1、DNMT3A和DNMT3B展开讨论。

DNMTs的结构和功能与机体组织器官的生长发育密切相关，例如，哺乳动物的减数分裂过程高度依赖于DNA甲基转移酶实现甲基化模式的重塑［5］。在骨折愈合的过程中，DNMT3B缺失诱发软骨发育缺陷，CXCL12和OPN等血管生成因子表达水平显著降低，阻碍血管生成、骨重塑等事件的发生［6］。在肿瘤细胞中，肿瘤抑制因子启动子高甲基化抑制抑癌基因的表达，或癌细胞整体低甲基化诱导基因组不稳定，促进了肿瘤的发生［7-9］。因此，DNA甲基转移酶在个体发育和疾病发生中发挥了重要作用，本文将对哺乳动物DNA甲基转移酶的结构特点、DNA甲基化的动态调节以及DNA甲基转移酶在个体发育和疾病发生中的作用等方面进行综述，旨在对DNA甲基转移酶的深入研究和应用奠定理论基础。

1 DNMTs的结构特征

DNMTs由N端调控域、C端MTase（methyltransferase catalytic domain，MTase）结构域和GK重复序列3部分组成［10］。N端调控域包含多个功能结构域，对DNMTs的转录抑制、细胞核定位、位点特异性结合以及酶活性调节至关重要［3，11-16］。DNMT1的N末端主要包括DNMT1相关蛋白1结合结构域（DNMT1-associated protein 1 binding domain，DMAPD）、增殖细胞核抗原结合结构域（proliferating cell nuclear antigen binding domain，PBD）、复制叉靶向序列（replication foci targeting sequence，RFTS）、CXXC 锌 指结构域和两个相邻的溴邻同源结构域（bromo-adjacent homology，BAH）［16-17］（ 图1）。DMAPD 是 DMAP1结合结构域，DMAP1是TIP60-p400组蛋白乙酰转移酶复合物的组成部分，对于维持胚胎干细胞的多能性至关重要［13］。PBD是PCNA结合结构域，有助于DNMT1与DNA复制叉结合，PBD缺失导致DNA复制后甲基化延迟［14，16］。复制叉靶向序列RFTS引导DNMT1结合到DNA复制叉位置，进而与含有PHD和RING指的泛素样结构域（ubiquitin-like with PHD and Ring finger domains 1，UHRF1）互作，通过UHRF1的SRA结构域识别并结合半甲基化的CpG位点，实现DNA甲基化的维持，在缺乏底物的情况下，RFTS将封闭催化中心，实现DNMT1自抑制机制［16，18-20］。CXXC 识别未甲基化 CpG 位点，通过与RFTS结合或者在DNA与DNMT1之间插入一段高酸性氨基酸序列（CXXC-BAH1自抑制连接子），阻断DNMT1的活性位点，抑制从头甲基化［3，18，21］。BAH 结 构 域 包 括 BAH1 和 BAH2，BAH1通过长接头片段与CXXC相连形成自抑制连接子，有助于CXXC、RFTs介导的DNMT1自抑制，BAH2参与DNMT1的定位和维持甲基转移酶活性，其与MTase结构域中的靶向识别结构域（Target recognition domain，TRD）相互作用参与酶活性的调节［3，19］。与 DNMT1 不同，DNMT3A 和 DNMT3B 的N端包含PWWP（Pro-Trp-Trp-Pro）和ADD（ATRXDNMT3-DNMT3L）结构域，而DNMT3L和DNMT3C的N端只有ADD结构域［22］（图1）。PWWP能识别并结合甲基化的组蛋白，介导DNMT3A/3B与染色质结合［5，23-25］。DNMT3A 的 PWWP 突变和缺失导致小鼠异常超甲基化并表现出生长滞后，DNMT3B与靶基因的结合也需要 PWWP 参与［5，26-27］。ADD能特异性结合未甲基化的H3K4（H3K4me0），调节酶的催化活性［15，28-29］。ADD结构域可与自身催化结构域相互作用，阻断DNA的结合，产生自抑制，而与H3K4me0结合可以破坏ADD结构域和催化结构域之间的互作，自抑制被解除［15，29-30］。

图1 小鼠DNMTs蛋白家族的保守结构域Fig.1 Conserved domains of mouse DNMTs protein family

C末端MTase结构域是DNMTs催化甲基转移的核心区域。MTase结构域包含10个不同的基序，其中6个（I、IV、VI、VIII、IX、X）在进化上高度保守，并且在催化过程中有直接作用［10，31］。I、II、III是SAM结合位点，I、X是辅助因子结合位点，IV（PCN）、VI（ENV）、VIII（RxRxR）是底物催化位点［10，31］。PCN中的Cys残基对靶碱基进行亲核攻击，ENV中的Glu残基与翻转碱基相互作用，并将胞嘧啶定位在活性位点，RxRxR中的Arg残基与酶-碱基复合物的脱质子化有关［11-12，31-32］。VIII和 IX 之间的一段保守程度较低的区域被称为靶向识别结构域（TRD），负责底物DNA上甲基化位点的识别［33］。DNMT1的C端单独存在时没有活性，BAH2与TRD的相互作用可能会导致MTase结构域的错误折叠［34-35］。DNMT3A和DNMT3B的C端单独存在时有活性，且比全长蛋白质的酶活性更高，其催化活性可能受N端调节结构域的变构调节［12，36］。

GK重复序列是一段赖氨酸-甘氨酸二肽重复序列，在进化上高度保守，负责将N端调控域和C端MTase结构域的连接［10］。目前的结构研究表明，GK重复序列不参与酶和DNA相互作用，但GK重复序列具有去泛素化酶USP7（ubiquitin-specific protease7）的结合位点，两者结合后，阻止DNMT1的泛素化和降解，在DNMT1介导的维持DNA甲基化中起调节作用［37］。研究还表明，GK重复序列可能参与小鼠ES细胞中DNMT1介导的父本印迹控制区的从头甲基化，说明DNMT1在必要情况下也可参与从头甲基化［19］。

2 DNMTs与DNA甲基化动态调节

DNA甲基化包括维持甲基化和从头甲基化（图2）。维持甲基化依赖于DNA复制过程，识别半甲基化CpG位点，催化甲基转移到新合成DNA链的CpG位点的胞嘧啶碳原子上［12，16］。DNA甲基转移酶DNMT1主要负责维持甲基化，需要UHRF1、H3K9me2/3等的协同作用，UHRF1可以将DNMT1招募到半甲基化CpG位点，H3K9me2/3介导UHRF1与染色质结合，UHRF1依赖于组蛋白修饰与DNMT1互作来实现维持甲基化的功能［38-40］。从头甲基化是指在未甲基化的CpG位点建立新的甲基化，主要在未分化细胞中表达，发生在胚胎发育和配子形成时期［41-42］。DNA甲基转移酶DNMT3A和DNMT3B主要负责从头甲基化，PWWP结构域通常识别并结合H3K9me2/3，参与DNA甲基化、组蛋白修饰、DNA修复和转录调控等多个与染色质相关的生物学过程，ADD结构域特异性结合未甲基化的H3K4，诱导构象发生改变以刺激酶的活性［3，15，24，28，31］。DNA去甲基化途径分为被动去甲基化和主动去甲基化［2，43］（图3）。被动去甲基化过程中，参与维持甲基化的DNMT1/UHRF1缺失，或参与从头甲基化的DNMT3A/3B减少，细胞发生快速去甲基化，基因组甲基化水平显著降低［2，38，40］；主动去甲基化过程中，10-11易位甲基化胞嘧啶双加氧酶（ten-eleven translocation methyl cytosine dioxygenases，TETs） 家族蛋白可将5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC），5hmC可进一步被氧化为5-甲酰胞嘧啶（5fC）和5-羟基胞嘧啶（5caC），TET1/2/3缺失小鼠细胞中 5mC 水平升高［2，16，44］。进一步的研究表明，5fC和5caC可在胸腺嘧啶DNA糖苷酶TDG（thymine DNA glycosylase，TDG）的作用下参与碱基切除修复（base excision repair，BER）途径，最终形成未被修饰的胞嘧啶［16，45-47］。

图2 DNA甲基化模式的建立和维持Fig.2 Establishment and maintenance of DNA methylation patterns

图3 DNA甲基化的动态调节Fig.3 Dynamic regulation of DNA methylation

3 DNMTs的生物学功能

DNA甲基化是一种涉及个体发育和疾病发生的表观遗传过程［17，48-49］。DNA甲基化与去甲基化的动态平衡对机体的正常运转是必需的，这种平衡状态被破坏会造成DNA甲基化模式紊乱，机体可能面临早期胚胎发育异常、生殖细胞发生缺陷、学习记忆能力受损、疾病发生等问题［16，31，49-57］。

3.1 DNMTs与个体发育

DNMTs活性的改变导致早期胚胎发育缺陷［1，41，58-59］。研究发现，胚胎干细胞 DNMT1 缺失，基因组发生去甲基化，导致细胞快速死亡［59-60］。DNMT3A突变小鼠胚胎发育几乎不受影响，但出生时表现出矮小表型，并在 4 周龄时死亡［1，26-27，41］。去除DNMT3B小鼠染色体着丝粒处小卫星重复序列去甲基化，并在妊娠后期死亡［1，58-59］。另外，早期胚胎发育过程中印迹基因甲基化的维持和X染色体的失活也与 DNMTs有关［4，61］。DNMT1 在卵母细胞和早期胚胎发育时期特异性表达，在维持印迹基因甲基化形式中发挥重要作用［61-62］。X染色体失活（X chromosome inactivation，XCI）使雄性（XY）和雌性（XX）之间的X染色体得到剂量补偿，防止雌性体内的两个X等位基因同时发挥作用，从而维持雌性体细胞正常的生长发育［63-66］。长链非编码RNA Xist（X-inactive specific transcript，Xist）的激活是XCI发生的重要原因，甲基化的Xist不能被转录，因此活性X染色体通常表现出高甲基化［4，66］。

DNMTs还参与原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs）甲基化的消除和随后性别特异性生殖细胞甲基化模式的建立［16-17］。研究表明，维持甲基化缺失是PGCs基因组去甲基化的主要原因，DNMT1和UHRF1参与PGCs中活性DNA的去甲基化［2，38］。在PGCs增殖和迁移过程中，UHRF1蛋白质水平下调，DNMT1不能准确定位到复制叉，维持DNA 甲基化减弱，PGCs发生去甲基化［2，38-40］。生殖细胞特异性的甲基化标记使精子或卵子建立性别特异性甲基化模式［16-17，66］。研究表明，DNMT3A和DNMT3L负责配子发生过程中印迹区域的从头甲基化，DNMT3A或DNMT3L缺失导致DNA甲基化印迹缺失，并显示整个基因组的低甲基化［1］。在UHRF1存在的特定条件下，DNMT1具有从头甲基转移酶活性［67］。Stella（也称为Dppa3或PGC7）通过抑制DNMT1和UHRF1介导的异常从头甲基化来保护卵母细胞甲基化水平，Stella缺失导致卵母细胞甲基化水平升高，阻碍合子基因组激活［68-69］。

3.2 DNMTs与疾病

3.2.1 DNMTs与癌症 癌症也称为恶性肿瘤，肿瘤细胞在恶性转化过程中通常表现出异常的DNA甲基化模式，具有全基因组低甲基化和局部高甲基化的特点［48，70-71］。肿瘤细胞的全基因组低甲基化，主要发生在基因编码区和卫星重复区，可能导致有丝分裂重组、拷贝数缺失和染色体重排［48，72］。局部高甲基化主要发生在抑癌基因启动子区域，研究发现，乳腺癌细胞中DNMT1、DNMT3B过表达分别导致ISL、BRCA1启动子高甲基化［73-74］。胃癌细胞中DNMT3A、DNMT3B过表达使ADAMTS9、MGMT、CNR1等抑制因子启动子甲基化水平升高［75-76］。DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在酒精性肝病组织和肝细胞癌中均上调［77-78］。以上研究表明，抑癌基因启动子高甲基化导致的基因表达沉默可能是癌症发生的重要原因。由于DNA甲基化异常具有重要的致病作用，因此靶向DNMTs的表观遗传疗法为癌症患者提供了新的治疗途径［51-52，55，79-81］。

3.2.2 DNMTs与神经系统疾病 DNMTs参与动物的学习记忆和神经系统退行性改变，大脑神经元的低甲基化与成人神经系统发生退行性改变有关［49，82］。研究发现，帕金森病（Parkinson Disease，PD）、阿尔兹海默症（Alzheimer disease，AD）患者DNA甲基化紊乱，DNMT1功能缺失可能是PD、AD等神经退行性疾病出现异常甲基化的基础［49，83］。研究表明，有丝分裂后神经元中的DNMT3A是正常记忆形成所必需的，在情景记忆中具有特殊作用［84］。DNMT3B的多态性可以调节环境对认知能力的影响，促红细胞素可以改善SAMP8小鼠的空间学习和记忆能力［85-86］。研究还发现，恐惧记忆重现使负面情绪迁延不愈，限制了抑郁症、焦虑症、创伤后应激障碍等多种精神疾病的治疗，而DNMT3A过表达可以阻止恐惧记忆重现，显著提高治疗效果［87］。

3.2.3 DNMTs与其他疾病 除了癌症和神经系统疾病，DNMTs还与代谢疾病、肾脏疾病、关节疾病等其他疾病有关。研究发现，DNMT1和DNMT3参与脂肪酸或炎性细胞因子诱导的DNA甲基化变化，脂肪细胞DNMT1的缺失会引起脂肪细胞肥大和葡萄糖稳态缺陷，导致肥胖、II型糖尿病及心血管疾病的产生［88-90］。慢性肾脏病中TGF-β信号诱导DNMT1、DNMT3A异常上调，导致Klotho启动子超甲基化，而阻断TGF-β信号或DNMT1、DNMT3A活性可以维持肾脏Klotho水平，有效缓解慢性肾脏病和肾脏纤维化［91-93］。骨关节炎小鼠过氧化物酶体增殖物激活 受 体（Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）明显下调，DNMT1/DNMT3A异常增多和PPARγ高甲基化可能是PPARγ被抑制的主要原因，PPARγ去甲基化可减轻小鼠骨关节炎程度［94］。

4 总结与展望

近年来，DNMTs及DNMT-底物复合物晶体结构的解析促进了我们对DNMT1维持甲基化和DNMT3从头甲基化的理解。DNMT1中RFTs、CXXC结构域和DNMT3中ADD结构域介导的自抑制机制保证了各自甲基转移酶的活性。但在一定条件下，DNMT1可以参与从头甲基化，DNMT3也可以参与维持甲基化，无催化活性的DNMT3B亚型还可作为其他甲基转移酶的辅助因子参与从头/维持甲基化。DNMTs参与DNA甲基化的动态调节，主要体现在DNA复制过程中DNA甲基化的维持、从头甲基化的建立和去甲基化三个方面，如何通过多种调控机制维持细胞的DNA甲基化动态平衡值得进一步探索。DNMT3A参与记忆形成与调节，异常DNA甲基化在多种疾病的发病机制中起重要作用，靶向DNMTs的小分子药物有望成为相关难治疾病的新疗法。然而，DNMTs在作用机制方面仍面临许多问题，例如，DNMTs的N-末端结构域是如何协调酶活性和基因组靶向性的？生殖细胞发生过程中印迹基因和性别特异性DNA的甲基化模式的建立是由什么决定的？以DNMTs为靶点的小分子药物是如何发挥作用的？个体因素是否对药效有影响？这些问题仍需要进一步研究，而对DNMTs结构和功能的研究将有助于DNA甲基化调控机制的阐明。