基于水稻原生质体的染色质免疫共沉淀技术优化及应用

石佳 朱秀梅 薛梦雨 余超 魏一鸣 杨凤环 陈华民

（中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

植物转录因子在植物生长发育和响应外界环境刺激等方面发挥着重要的作用［1-2］，转录因子通过与DNA启动子相结合进而调控下游靶基因的表达，从而发挥各种重要的生物学调控功能。因此，挖掘、验证转录因子的靶基因是解析其生物学功能机制的关键环节。研究蛋白与DNA互作的常用方法有凝胶迁移阻滞试验［3］、酵母单杂交系统［4］和荧光素酶报告系统［5］，这些方法都属于体外方法，且更适用于具体蛋白和DNA作用的验证，并不适合用于大规模筛选未知DNA序列。建立在蛋白质和DNA交联基础上的染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation，ChIP）［6-7］则是探索体内蛋白质-DNA复合物结合情况的重要技术手段。其原理是在活细胞状态下用甲醛交联固定蛋白质-DNA复合物，然后将染色质随机破碎为一定长度范围内的小片段，通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性的富集与目的蛋白结合的DNA片段，继而通过对目的片段进行纯化与检测，获得与蛋白质相互作用的DNA信息及调控基因信息［8］。近年来，随着此技术的不断完善和发展，尤其是与DNA芯片技术（ChIP-chip）和高通量测序（ChIP-seq）相结合，可以一次性得到目的蛋白在整个基因组上的结合分布，并得到目的蛋白的精确结合位点以及结合基序等信息［9］，因此染色质免疫沉淀技术逐渐成为分析表观修饰和挖掘特定转录因子靶基因的强有力手段。

然而，ChIP试验操作繁琐，对目的DNA片段的富集高度依赖特异性抗体，容易出现假阴性/假阳性，重复性差等缺点，且在植物相关研究中，通常是利用过表达目的基因的转基因植株作为研究材料，但构建转基因材料耗时耗力，且有些蛋白在植物体内积累丰度较低，这些都对实验的顺利开展和圆满完成带来了不利因素。

植物转录因子NF-YA（nuclear factor Y subunit A，NF-YA核因子A亚基）与NF-YB和NF-YC共同组成异源三聚转录复合体NF-Y（又名血红素激活蛋白，HAP；CCAAT结合因子，CBF）。NF-Y复合体广泛存在于真核生物中，通过与CCAAT-box特异结合调控目的基因的表达。CCAAT-box是存在于25%以上的真核生物基因启动子的一种顺式作用元件，调节启动子的活性［10］。NF-YA主要通过脱落酸（ABA）途径调控植物对非生物和生物胁迫的响应［11-13］。研究表明NF-YA基因在调节植物耐旱性［14］、氮素吸收利用［15］、根瘤发育［16］、脱落酸（ABA）响应［17］和开花时间［18］等方面具有重要功能。

本研究在水稻原生质瞬时表达系统中，通过对甲醛交联固定和免疫沉淀核酸的超声波破碎等影响该试验成功的关键因素进行优化，建立了基于水稻原生质体的染色质免疫共沉淀技术（chromatin immunoprecipitation system based on rice protoplasts，ChIP-RP），并以水稻转录因子OsNF-YA4为例，通过ChIP-RP技术完成了OsNF-YA4调控靶基因的富集验证。此技术体系一方面可以最大限度地缩短样品准备时间，另一方面水稻原生质体表达系统更接近于水稻体内环境，目的蛋白表达容易，干扰少，目的蛋白所占比重更大，不必再进行细胞核蛋白的分离，可以有效提高ChIP效果。本研究利用优化后的水稻原生质体染色质免疫共沉淀技术验证了转录因子OsNF-YAs对下游基因的富集作用，表明ChIPRP是一个可以用于水稻转录因子靶基因挖掘的技术体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与耗材 构建载体所需Primer Star MAX、rTaq mix等PCR试剂购于TaKaRa公司；限制性内切酶、T4连接酶购于北京NEB公司。大肠杆菌Trans-T1购于北京全式金生物技术有限公司。鼠源抗Myc标签单克隆ChIP级别抗体购自Abcam（英国）。Magna ChIPTMProtein A+G Magnetic Beads 购自德国merck millipore 公司。MinElute PCR Purification Kit购自德国QIAGEN公司。超声破碎仪XC96-11N购自南京新辰生物科技有限公司。染色质免疫共沉淀试验所需的Lysis buffer、RIPA ChIP buffer、RIPA buffer、LiCl wash buffer、TE buffer均参考 Para 等［19］描述的方法进行配制。

1.1.2 材料 水稻品种日本晴（Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare）为实验室所保存，所用载体质粒pRTV-Ubi-3Myc由中国农业科学院植物保护研究所宁约瑟［20］课题组馈赠。

1.2 方法

1.2.1 水稻的培养 挑选颗粒饱满的水稻种子置于20 mL锥形瓶，加入75%酒精，摇晃1 min，倒掉酒精；加入40%次氯酸钠，摇晃30 min消毒，倒掉次氯酸钠；用灭菌蒸馏水清洗3-5次，将吸干表面水分的种子平铺于1/2 MS（Murashige & Skoog basal medium with vitamins 2.21 g/L，蔗糖20 g/L，植物凝胶0.3 g/L）培养基，置于28℃培养箱中避光培养10 d左右。

1.2.2 融合Myc标签的NF-YA4表达载体的构建 以水稻cDNA为模板，采用引物NF-YA4-F：5'-ATAGAGCTCATGGAGTCGAGGCCGGGGGG-3'；NFYA4-R：5'- TATGGTACCTGTTTCCTTCTGTAGGAGC TG-3'扩增OsNF-YA4基因，经过SacI和KpnI双酶切后，将其插入经过同样双酶切的pRTV-Ubi-3Myc载体，获得pRTV-NF-YA4-3Myc重组载体。

1.2.3 原生质体的制备与转化［21-22］按照原生质体制备方法分离提取4×107细胞，用40% PEG4000（40%（W/V）PEG4000，0.1 mol/L CaCl2，5 mmol/L MES，0.2 mol/L D-mannitol）介导质粒的转化。

1.2.4 原生质体瞬时表达OsNF-YA4蛋白水平的检测 1 000×g离心收集原生质体，沉淀用100 μL Tris-HCl buffer（50 mmol/L Tris-HCl pH7.5，150 mmol/L NaCl，0.1% Triton X-100，4 mol/L Urea，1 mmol/L PMSF） 悬 浮，4℃，13 300 r/min离 心 10 min，取上清加入5 × Loading buffer煮沸10 min。Western blot检测在不同时间点NF-YA4蛋白的积累水平［14］。一抗采用抗Myc标签的单克隆抗体（Gene Script）（稀释度为1∶5 000），二抗采用山羊抗小鼠IgG抗体（华兴博创）（稀释度为1∶10 000）。

1.2.5 甲醛对原生质体状态的影响 设置0.1%、0.3%、0.7%、1%等不同浓度甲醛分别处理原生质体细胞10 min，125 mmol/L甘氨酸处理5 min终止交联，通过显微镜观察细胞状态，利用血球计数板统计64个视野下的细胞数目，计算处理后细胞数目占初始数目的百分比，数据为3次生物学重复所得。

1.2.6 DNA超声破碎时间的筛选 取甲醛固定好的原生质体细胞，加入1 mL Lysis buffer，涡旋混匀，置于2 mL离心管中进行超声破碎。超声破碎仪功率39%，超声时间设置为3 s，超声间隔时间设置为9.9 s，超声总时长分别设置为5 min、10 min、15 min、20 min、30 min。超声破碎后4℃，13 300 r/min离心10 min，取上清65℃过夜解交联并消化蛋白，酒精沉淀DNA，2% DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化效果。

1.2.7 免疫共沉淀

1.2.7.1 染色质样品的预处理 将超声破碎后的染色质样品溶于5 mL RIPA ChIP buffer，4℃，13 300 r/min离心10 min，取上清于新的10 mL离心管。吸取500 μL染色质作为10% input对照，冻于- 20℃。在剩余染色质中加入20 μL protein A/G beads，4℃低温混合处理样品1 h，去除可与protein A/G beads非特异性结合的蛋白。

1.2.7.2 抗原抗体的特异性结合 将预处理的样品等分为两份，一份加与10 μg Myc标签抗体结合的磁珠，标记为ChIPs+，一份加不与抗体结合的磁珠标记为ChIPs-，两组处理同时置于4℃低温，缓慢混合孵育处理6-8 h以形成磁珠-抗体-抗原蛋白-目的DNA免疫复合物。

1.2.7.3 磁珠-抗体-抗原蛋白-目的DNA免疫复合物的清洗 为减少非特异性结合，磁力架分离磁珠和染色质，依序用以下每种溶液清洗两次，一次快洗，一次慢洗（4℃低温洗5 min）。清洗溶液有：RIPA buffer，LiCl wash buffer，TE buffer。第一次 TE buffer后，ChIPs+样品与ChIPs-样品分别取200 μL，利用Western blot检测免疫沉淀效果。

1.2.7.4 解交联与DNA纯化［23］磁力架捕获磁珠，并除净 TE buffer。加入 250 μL Elution buffer，65℃孵育15 min，用来洗脱抗体和染色质的复合物。磁力架分离把上清转移至一个新的离心管。重复洗脱步骤，加入新的250 μL Elution buffer，65℃孵育30 min。把两次洗脱液混合在一起，总体积为500 μL。每管加入 25 μL 4 mol/L NaCl，10 μL RNase A，37℃孵育2 h然后65℃孵育4 h以上至过夜以解交联。

在离心管中加入 10 μL 0.5 mol/L EDTA，20 μL 1 mol/L Tris-HCl pH6.5，1 μL proteinase K（20 mg/mL），45℃孵育1.5 h以降解蛋白。利用QIAGEN公司的MinElute PCR Purification Kit回收所富集目的DNA片段，Nano Drop ND-1000仪定量检测DNA浓度后-20℃保存。

1.2.8 相关基因启动子CCAAT序列预测及富集DNA的特异性分析 Plant CARE软件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）［24］预 测NRTs相关基因启动子序列中CCAAT序列的数目及位置（表1）。以 OsNRT1.1、OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNAR2.1为研究对象设计引物（表2），以染色质免疫沉淀纯化后的DNA（ChIPs+，ChIPs-，input）为模板，利用RT-qPCR检测染色质免疫共沉淀所富集DNA的特异性。以input为内参，按照2-ΔΔCt法计算，其中 ΔΔCt =（CtChIPs+- Ctinput）-（CtChIPs-- Ctinput），Ct为荧光阈值。

表1 NRTs基因启动子区域调控元件的预测Table 1 Prediction of regulatory elements in the promoter region of NRTs genes

表2 RT-qPCR验证所需的引物序列Table 2 Required primer sequences for RT-qPCR validation

2 结果

2.1 OsNF-YA4瞬时表达载体的构建

利用SacI和KpnI 同时酶切OsNF-YA4基因和pRTV-Ubi-3Myc，回收连接后转入大肠杆菌Trans-T1，构建pRTV-NF-YA4-3Myc融合表达载体（图1），挑选阳性菌落克隆送华大基因测序，测序结果表明，OsNF-YA4基因的重组表达载体pRTV-NFYA4-3Myc无碱基突变和移码，说明pRTV-NF-YA4-3Myc载体构建成功。

图1 pRTV-NF-YA4-3Myc载体示意图Fig.1 Schematic diagram of pRTV-NF-YA4-3Myc vector

2.2 OsNF-YA4蛋白积累水平的变化

染色质免疫沉淀效果与目的蛋白的表达量有着紧密的联系。水稻原生质体转化是一个瞬时表达的过程，根据孵育时间的不同，蛋白表达水平会有所变化，为确定OsNF-YA4融合蛋白在水稻原生质体中积累水平较高的时间，分别在转化后 12 h、18 h、24 h、36 h，1 000 ×g离心收集细胞，提取蛋白，采用anti-Myc单抗进行Western blot检测OsNFYA4蛋白表达量。结果如图2所示，转化后12 h时，OsNF-YA4蛋白积累最多，随着时间延长蛋白积累水平呈下降趋势，转化后36 h，蛋白水平明显降低。因此，确定在水稻原生质体转化后12 h进行甲醛固定处理。

图2 原生质体转化后OsNF-YA4蛋白表达水平的检测Fig.2 Expressions detection of OsNF-YA4 protein after protoplast transformed

2.3 甲醛交联浓度的筛选

甲醛处理可以固定蛋白质与DNA的结合，是染色质免疫沉淀至关重要的一步。通常采用1%甲醛真空压渗来处理植物材料，鉴于原生质体本身比较脆弱易破，首先采用不同浓度甲醛处理原生质体细胞，显微镜下观察细胞状态。结果表明不同的甲醛浓度都对原生质体的状态造成一定的影响，随着甲醛浓度的升高，原生质体细胞活性也随之降低（表3）。0.1%甲醛处理后，原生质体的细胞活性为93%，影响相对轻微；1%甲醛浓度处理后，原生质体的细胞活性下降为48%，约一半细胞已破碎，难以保证正常的细胞生理功能。综合甲醛处理的重要性和原生质体的细胞活性，选取0.7%甲醛来处理水稻原生质体细胞，交联固定10 min。

表3 不同甲醛终浓度对原生质体细胞活性的影响Table 3 Effects of different final concentrations of formaldehyde on protoplasmic cell activity

2.4 染色质超声波破碎时间的筛选

染色质片段大小在很大程度上影响了ChIP的实验效果，通常在100 bp-500 bp之间为好，因此需要利用超声破碎仪对染色质进行片段化处理。通过设置不同的超声时长破碎染色质，琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化效果。结果表明随着超声时长的增加，DNA片段逐渐变小（图3-A）。当超声时长为5 min时，部分DNA片段被打断至1 000 bp左右，片段较大；当超声时长为15 min和20 min时，DNA片段长度集中在100 bp-500 bp之间，符合后续实验要求；当超声时长为30 min时，大部分DNA片段已被破碎至200 bp左右，表明超声过度（图3-A）。在相同条件下，超声时间过长，蛋白容易降解，所以确定超声时长为15 min。超声15 min后，将染色质免疫共沉淀中的input样品解交联后，用2%琼脂糖凝胶检测，结果表明，DNA片段在100 bp-500 bp之间，主带在250 bp左右，符合后续高通量测序要求（图3-B）。

图3 OsNF-YA4蛋白ChIPs富集DNA的超声破碎时间优化（A）和效果检测（B）Fig.3 Optimization of ultrasonic fragmentation time on OsNF-YA4 ChIPs-enriched DNA（A）and validation of the fragmentation（B）

2.5 染色质免疫共沉淀效果的检测和富集DNA特异性的分析

ChIPs+样品与ChIPs-样品在第一次TE Buffer清洗后，吸取总样品的20%，加5×Loading buffer，Western blot检测免疫沉淀效果，结果如图4-A所示，利用anti-Myc单抗可以检测到ChIPs+样品中NF-YA4融合蛋白的条带，而在ChIPs-样品中未检测出条带，说明免疫沉淀效果较好。ChIPs+样品、ChIPs-样品和input样品经过解交联，消化蛋白质，获得已纯化的DNA样品。

图4 染色质免疫共沉淀效果的检测（A）和所富集DNA的特异性分析（B）Fig.4 Detection of the effect of chromosome immunoprecipitation（A）and specificity analysis of enriched DNA（B）

生物信息学分析发现NRT 家族成员启动子区域分布着若干 OsNF-YAs 结合的CCAAT 序列（表1），推测转录因子 OsNF-YAs 可通过与 NRTs基因启动子区域的 CCAAT结合，从而调控 NRT 家族成员的表达。所以以ChIP富集DNA为模板，OsNRT1.1、OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNAR2.1基因启动子中含有CCAAT序列的片段为研究对象，OsNAR2.1基因启动子中不含CCAAT序列的片段为阴性对照，RT-qPCR检测染色质免疫共沉淀所富集DNA特异性。结果发现ChIPs+样品相对ChIPs-样品，基因OsNRT1.1、OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNAR2.1 启动子中含有CCAAT序列的片段富集倍数从5倍到50倍不等，OsNAR2.1基因启动子中不含CCAAT序列的片段无明显富集，说明成功富集到转录因子NF-YA4特异性结合的DNA片段。

3 讨论

蛋白质与DNA互作相关研究一直是表观遗传学领域的研究热点，ChIP作为研究蛋白质与DNA互作的传统手段，在动植物中得到了广泛应用。然而，高特异性的蛋白抗体和高丰度的蛋白积累是植物材料ChIP的主要限制因素。构建稳定遗传的过表达植物材料可以在很大程度上突破上述问题对ChIP技术的限制，然而，构建稳定遗传材料耗时耗力。利用植物材料进行ChIP时，通常还要提取细胞核蛋白以避免植物中过多杂蛋白的干扰。此外，植物材料的次生代谢物和细胞壁会干扰甲醛交联效果，甲醛交联对ChIP结果的影响较大。甲醛处理的时间太短或甲醛浓度过低，会导致蛋白质和DNA形成的复合物交联不牢固，很容易在超声时分离；甲醛固定的时间太长，会使目的蛋白的抗原决定簇被屏蔽，不能和抗体有效结合，引起免疫沉淀效果降低［25］；甲醛浓度过高，叶绿素不易降解，导致与叶绿体连在一起的细胞核中的染色质难以纯化［26］。植物细胞壁的存在阻碍了甲醛的穿透，不易利用ChIP-seq识别植物转录因子的靶基因结合位点，当交联剂到达完整植物细胞的细胞核时，瞬时的转录因子相互作用可能已经停止［19］。

为规避以上不利因素，本文建立了基于水稻原生质体瞬时表达系统的染色质免疫共沉淀技术（chromatin immunoprecipitation based on rice protoplast transient expression system，ChIP-RP）。通过不同浓度梯度甲醛对原生质体细胞活性的影响，发现0.7%甲醛终浓度对细胞活性伤害相对较小，也可以满足DNA与蛋白质的交联效果。原生质体提取过程中剔除了植物细胞壁和绝大多数干扰蛋白，可以将交联的原生质体直接震荡破碎，超声处理，避免了细胞核蛋白的提取步骤。染色质免疫共沉淀过程中，超声破碎细胞染色质的程度对试验成功至关重要。超声不彻底会引起染色质蛋白复合物过大，抗体不易富集，影响后续试验；超声过度会引起蛋白降解或蛋白抗原表位被破坏，影响后续免疫沉淀过程［27］。一般认为DNA打断片段在100 bp-500 bp之间，主带在250 bp左右符合后期的高通量测序建库要求。我们采用不同时长超声破碎，结果表明超声功率39%，3 s运行，9.9 s间歇，超声15 min是水稻原生质体染色质破碎最适条件。

OsNF-YAs作为转录因子可以与CCAAT序列特异结合，从而通过调控NRT家族基因的表达而发挥其生物学功能。我们以OsNF-YA4为目标蛋白，通过ChIP-RP技术免疫沉淀了OsNF-YA4结合的DNA序列，qRT-PCR检测说明含CCAAT序列的片段得到了明显的富集，其中OsNRT2.1启动子片段富集高达50多倍，而不含CCAAT的对照片段则没有富集，表明OsNF-YA4富集到的DNA具有明确的特异性。

4 结论

本研究通过对水稻原生质体瞬时表达、甲醛交联浓度、超声破碎条件等关键条件的优化，建立了基于水稻原生质体的染色质免疫共沉淀技术体系（ChIP-RP），并通过水稻转录因子OsNF-YA4免疫沉淀富集到DNA的特异性验证了ChIP-RP的适用性。本技术体系可用于快速筛选和挖掘水稻转录因子直接调控的靶基因，为解析水稻转录因子的分子机制提供了极大的便利。