m6A甲基化修饰相关酶基因在牛脂肪生成中的表达分析

杨昕冉 王建芳 马鑫浩 昝林森，2

（1.西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100；2.国家肉牛改良中心，杨凌 712100）

牛肉因其高蛋白、低胆固醇，且富含人体需要氨基酸，越来越受到人们的青睐，但我国肉牛仍存在良种率偏低、产肉性能和肉品质差等问题。秦川牛作为我国地方良种黄牛，个体抗逆性好、耐粗饲、具有被开发和培育成生产高品质牛肉的专门化肉牛品种的潜力［1］。如何进一步利用我国以秦川牛为代表的地方黄牛优质种质资源，提高牛肉品质，是我国肉牛产业亟待解决的科学问题。

许多研究表明肌内脂肪的分布和含量决定了大理石花纹丰度——衡量牛肉品质的重要指标。动物体内脂肪的沉积和脂质的合成主要是由脂肪细胞数量增多（前体脂肪细胞的增殖）、体积增大（脂肪细胞分化、甘油三酯积累、脂滴增大）和成熟来决定［2］。前体脂肪细胞的增殖和分化除了受到一系列特定且关键的转录因子调控外［3］，还受到如DNA甲基化［4］、组蛋白修饰［5］等表观遗传的调控。而RNA N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）作为近几年的研究热点，其对脂肪发育的重要调控作用逐渐被发现。作为mRNA中最常见的甲基化修饰，m6A修饰被证明具有动态可逆性，主要由包括甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase 3，METTL3）、甲基转移酶样蛋白 14（methyltransferase 14，METTL14）［6］和肾细胞瘤 1-结合蛋白（Wilms’ Tumor 1-Associating Protein，WTAP）［7］等组成甲基转移酶复合物催化RNA上腺苷酸发生m6A修饰，同时脂肪量与肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）［8］和 Alk B同源蛋白 5（AlkB Homolog 5，ALKBH5）［9］等去甲基化酶可以对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。

越来越多的证据表明m6A修饰通过在转录后水平调控RNA的稳定性、定位、运输、剪切和翻译进而在调控细胞命运、细胞周期、胚胎干细胞重编程、个体发育等方面发挥着重要的生物学功能［10-13］。近年来，m6A在脂肪生成中的调控作用也不断被发现，在FTO被发现可作为重要的肥胖候选基因后［14］，更多研究发现FTO可通过调控靶基因m6A的水平影响可变剪切、自噬通路、有丝分裂的克隆扩增等生物学过程进而促进脂肪生成［15-17］。METTL3可以通过促进CCNA2、FASN、JAK1等基因mRNA的m6A修饰调控脂肪生成［18-20］，近期研究还发现了METTL3对小鼠棕色脂肪的生成至关重要［21］。此外，国内陆续在猪、鸡等畜禽动物中发表了脂肪组织发育的转录组水平的m6A甲基化修饰图谱，揭示m6A在畜禽脂肪生成和沉积中的潜在作用［22-23］。但m6A甲基化修饰对牛脂肪发育和脂质合成的研究鲜见报道，同时其在体外调控前体脂肪细胞增殖与分化的功能和机制仍不明确。

本研究分析METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5等m6A甲基化修饰相关酶基因在秦川肉牛体内不同组织以及在体外前体脂肪细胞增殖、分化过程中的表达模式。一方面为秦川肉牛的遗传改良和分子育种提供理论依据，另一方面从新的表观遗传修饰角度研究RNA甲基化对脂生成的潜在作用。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用牛只为西北农林科技大学国家肉牛改良中心良种繁育场培育的秦川肉牛，分别选取3头身体健康、状态良好的新生（1日龄）和成年秦川肉牛（36月龄），分别采集其心、肝、脾、肾、背最长肌、前腿肌、后腿肌和脂肪组织样品，置于-80℃保存待用。

1.2 方法

1.2.1 前体脂肪细胞分离、培养与分化 从上述新生秦川肉牛肾周脂肪中分离前体脂肪细胞。取脂肪组织剪碎，加入等体积的I型胶原酶，37℃消化60 min，加入含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基（完全培养基）终止消化，依次过100 μm和40 μm的细胞筛，滤液在1 500 r/min、4℃下离心10 min，收集沉淀且重悬于完全培养基中，吹打均匀后接种于细胞培养瓶。细胞生长至80%-100%密度时，进行传代培养，将细胞接种于6孔细胞培养板。待细胞长满时，将含有10%FBS和1%双抗的DMEM/F12培养基换成含有10%FBS、0.01%地塞米松、0.3% 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1%胰岛素和1%双抗的DMEM/F12培养基，诱导成脂分化。2 d后换成含有10%FBS、1%胰岛素和1%双抗的DMEM/F12培养基，维持成脂分化，每2 d进行一次换液。

1.2.2 RNA提取与cDNA合成 使用Trizol法提取组织和细胞中的总RNA，通过酶标仪检测RNA的纯度和浓度，放于-80℃保存备用。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反转录试剂盒（TaKaRa，大连）将总RNA反转录为cDNA，其中去除DNA反应体系为：依次加入2.0 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1.0 μL gDNA Eraser、1 000 ng总RNA，RNase-free ddH2O补足 10 μL，42℃反应2 min。反转录反应体系为：在上述反应液中依次 加 入 4.0 μL 5×PrimeScript Buffer、4.0 μL RNasefree dH2O、1.0 μL RT Primer Mix 和 1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix， 共 计 20 μL，37℃ 反 应 15 min，85℃中15 s终止反应。cDNA放于-20℃保存备用。

1.2.3 实时荧光定量PCR（RT-qPCR） 使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNase H Plus）（TaKaRa，大连）荧光定量试剂盒进行RT-qPCR。15 μL的反应 体 系 为 ：7.5 μL TB Green Premix Ex Taq（2×）、各0.5 μL的上下游引物、1.5 μL cDNA模板（10倍稀释）和 5.0 μL RNase-free H2O，95℃ 30 s，95℃ 3 s、60℃ 30 s、40个循环。使用GAPDH（组织表达谱使用）或β-actin（细胞试验使用）为内参基因，每个样品均设置至少3个生物学重复，采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。RT-qPCR所用的引物见表1。

表1 RT-qPCR所用引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.2.4 油红O染色 油红O工作液配制：0.5 g油红O染料溶于100 mL异丙醇后为油红O原液，将原液与ddH2O按3∶2混合，过滤后为油红O工作液。染色：弃去细胞培养基并用PBS漂洗细胞3遍，加入4%多聚甲醛室温固定30 min。弃去固定液再用PBS漂洗3遍，加入油红O工作液染色30 min。弃去染液，PBS洗净后在倒置显微镜下观察并记录脂滴形成情况。

1.2.5 统计分析 使用GraphPad Prism 7.00软件（GraphPad Software公司，美国）进行数据统计分析并生成图片。分别用独立样本t检验和单因素方差分析（One-way ANOVA）比较两组和多组之间的差异，以P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，结果以平均值±标准差来表示，每组设置至少3个生物学重复。

2 结果

2.1 m6A甲基化修饰相关酶基因在秦川肉牛不同组织中的表达分析

为了检测m6A甲基化修饰相关酶基因在不同月龄秦川牛各组织中的表达水平，分别采集了新生牛和成年牛的心、肝、脾、肾、背最长肌、前腿肌、后腿肌和脂肪等组织。RT-qPCR的结果发现，在新生牛不同组织中，m6A甲基转移酶METTL3、METTL14、WTAP和去甲基化酶FTO、ALKBH5的组织表达谱相似，均是在肝和脾中高表达，在心脏以及背最长肌、前腿肌和后腿肌等骨骼肌中低表达，而在肾和脂肪组织中的表达稳定且水平基本一致（图1-A-E）。在成年牛中的表达模式与新生牛不同的是，除了在肝和脾中高表达外，METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5在成年牛肾脏和脂肪组织中也表现出高表达水平（图1-F-J），并且METTL3、METTL14、WTAP和FTO不管在新生牛还是在成年秦川肉牛的脂肪组织中的表达量均显著高于肌肉组织（P＜0.05），而ALKBH5在肌肉和脂肪组织中的表达无显著差异。

为了分析m6A甲基化酶基因在秦川牛脂肪发育中的潜在作用，进一步比较了m6A甲基转移酶METTL3、METTL14、WTAP和 去 甲 基 化 酶 FTO、ALKBH5在新生牛和成年牛脂肪组织中的表达差异。结果显示，不管是甲基转移酶还是去甲基化酶在成年牛脂肪组织中的表达量均显著高于新生牛（P＜0.05）（图1-K），说明m6A甲基化修饰可能对于牛的脂肪发育具有潜在且复杂的作用机制。其中，FTO的表达水平相对较高且表达差异最明显，ALKBH5的表达量相对最低，暗示FTO可能在调控牛脂肪发育中发挥重要作用。

图1 m6A甲基化相关酶基因在秦川肉牛不同组织中的表达Fig.1 Expressions of m6A methylation-related genes in different tissues of Qinchuan beef cattle

2.2 秦川肉牛前体脂肪细胞的增殖检测

为了进一步研究m6A甲基化酶基因在牛体外前体脂肪细胞中的表达模式，在新生秦川肉牛中分离了前体脂肪细胞。如图2-A所示，将第3代前体脂肪细胞接种到6孔细胞培养板培养后，细胞可以正常增殖，生长状态良好，细胞数量随天数逐渐增多。前体脂肪细胞的生长曲线也基本呈现“S”型，从前期缓慢生长到中期指数增长，在第7天细胞基本长满且达到生长平台期（图2-B）。这些结果表明本研究分离的前体脂肪细胞具有正常生长增殖的能力。

图2 秦川肉牛前体脂肪细胞的形态与生长曲线Fig.2 Morphology and growth curve of preadipocytes from Qinchuan beef cattle in vitro

2.3 秦川肉牛前体脂肪细胞的成脂分化

待前体脂肪细胞长满后诱导成脂分化，并使用油红O进行脂滴染色。结果如图3-A所示，在诱导分化第3天时，围绕细胞核成簇分布的小脂滴开始出现。而后随着诱导时间延长，脂滴增多且逐渐融合形成大脂滴。同时提取了前体脂肪细胞分化第0、3、6、9、12天的总RNA，对调控成脂的关键转录因子——过氧化物酶体增生因子激活受体γ（PPARγ）、CCAAT 增强子结合蛋白 α（C/EBPα）、CCAAT增强子结合蛋白β（C/EBPβ）以及参与脂肪合成代谢的基因——脂肪酸结合蛋白4（FABP4）进行了RT-qPCR检测。结果发现参与成脂分化早期的转录因子PPARγ和C/EBPα的表达在第3天显著上升，随后下降（P＜0.05）（图3-B）。而在成脂分化中后期发挥调控作用的C/EBPβ的表达在分化前期逐渐上升，分化后期有所下降但仍维持较高表达水平（图3-B）。FABP4的表达则随着成脂分化的进行而不断增加（图3-B）。这些成脂分化标志基因在牛前体脂肪细胞分化的时序表达趋势以及脂滴的形成与脂肪细胞成脂分化的一般规律相符。这些结果表明本试验分离的牛前体脂肪细胞具有正常的成脂分化能力，可以进行后续试验研究。

图3 秦川肉牛前体脂肪细胞成脂分化检测Fig.3 Detection of preadipocytes adipogenic differentiation in Qinchuan beef cattle

2.4 m6A甲基化修饰相关酶基因在前体脂肪细胞增殖过程中的时序表达谱

对5个m6A甲基化酶基因在牛前体脂肪细胞增殖期的不同时间点（第1、2、3、4、5、6、7天）进行了相对表达量检测，结果如图4所示。m6A甲基转移酶METTL3的表达量在增殖前期逐渐降低，METTL14、WTAP也均与之一样在第3天达到最低表达量，且在第4天有所上升，但仅维持较低的表达水平。而m6A去甲基化酶FTO在增殖前期基本无变化，随后呈缓慢上升趋势（P＜0.01）；另一个m6A去甲基化酶ALKBH5的表达先升高后下降（P＜0.01），在增殖中后期不断升高（P＜0.01）。这些结果表明，m6A甲基转移酶METTL3、METTL14和WTAP可能在牛前体脂肪细胞增殖前期具有潜在的调控作用，而m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5可能在增殖中后期发挥作用。

图4 m6A甲基化相关基因在前体脂肪细胞增殖过程中的时序表达谱Fig.4 Temporal expression profile of m6A methylationrelated genes during preadipocytes proliferation

2.5 m6A甲基化修饰相关酶基因在前体脂肪细胞分化过程中的时序表达谱

同样地，使用RT-qPCR检测了5个基因在牛前体脂肪细胞成脂分化不同时间点（第0、3、6、9、12天）的时序表达模式。结果如图5所示，甲基转移酶METTL3、METTL14和去甲基化酶FTO的表达趋势基本一致，均在分化前期下降（P＜0.01），在第6天上升至高表达（P＜0.01），随后又逐渐降低。而WTAP与ALKBH5的表达变化相似，前期维持稳定表达，在第6天表达显著增加且随后继续维持高表达水平至分化晚期第12天。这些结果暗示这些m6A甲基化修饰相关酶基因可能具有潜在的调控牛前体脂肪细胞分化、影响脂肪生成的功能。

图5 m6A甲基化相关基因在前体脂肪细胞分化过程中的时序表达谱Fig.5 Temporal expression profile of m6A methylationrelated genes during preadipocytes differentiation

3 讨论

尽管m6A甲基化修饰早在20世纪70年代就被发现［24］，但因为过去实验技术方法的限制，一直没能引起人们的重视。而随着m6A甲基化修饰动态可逆模式［8］和高通量测序技术［25-26］的发展，m6A修饰发挥的生物学功能不断被揭示，RNA甲基化研究也成为近十年的研究热点。m6A已被发现可影响如多种癌症细胞增殖转移、胚胎干细胞分化、细胞命运决定等多个生物学过程［27-30］。近年来，m6A在畜禽肌肉和脂肪发育中的修饰模式和潜在作用也不断被发现［21-23，31-34］。但m6A修饰在牛体内和体外脂肪发育方面研究仍未见报道，而我国本地黄牛品种的脂肪沉积能力较国外优良肉牛品种仍有一定差距，国内肉牛行业仍需围绕促进牛肉脂肪沉积，增加大理石花纹，提高牛肉品质等方面开展科研创新。本研究选用国内良种黄牛——秦川肉牛为研究对象，研究m6A修饰相关甲基化酶基因METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5在秦川肉牛不同组织中的表达水平，比较其在新生牛和成年牛脂肪组织中的表达差异；并分离出具有正常增殖和成脂分化能力的前体脂肪细胞，检测这5个基因在秦川肉牛前体脂肪细胞增殖和成脂分化过程中的表达情况。

关于m6A修饰相关基因在动物体内不同组织中的表达研究较少，为了探究m6A修饰相关甲基化酶在牛不同组织中的表达特异性，对5个经典的m6A甲基化酶基因进行了表达量检测。得到的结果与朱琳娜等［35］在不同品种猪的不同组织中关于FTO和METTL3的表达研究结果一致，均是在骨骼肌中低表达，在肝脏中高表达。此外，上述研究还发现了FTO和METTL3在不同品种猪的脂肪组织中有着稳定的表达，本研究结果也表明除ALKBH5外，METTL3、METTL14、WTAP和FTO在脂肪组织中的表达显著高于肌肉组织。另一项研究表明，FTO在大鼠的多种组织中均有表达［36］，与本研究不同的是该研究的数据显示FTO在大鼠骨骼肌中表达要高于脂肪组织，本研究则是发现FTO在牛脂肪组织中的表达量显著高于骨骼肌。另外，马子玉等［37］的研究发现METTL3在猪的不同组织和器官中广泛表达且差异较不明显。这些不同结果的产生可能是由于品种间的差异所致。此外，这5个基因在牛的肝脏中均有明显的高表达水平，暗示m6A修饰可能对牛肝脏功能的调控具有潜在作用，多个研究发现m6A修饰在肝脏疾病中发挥重要作用也支持此推论［38-39］。再综合这5个基因在成年牛脂肪组织中高表达的结果，表明m6A修饰相关酶基因与牛脂肪沉积、代谢和发育性能密切相关。

在体外研究脂肪细胞的功能可以便于更好地理解脂肪生成的分子机制。根据脂肪细胞分化过程中的变化一般将脂肪细胞分为：脂肪母细胞、脂肪前体细胞、前脂肪细胞和成熟的脂肪细胞［40-41］，其中前体脂肪细胞是脂肪组织基本的生物学单位，其增殖分化能力的持续发生伴随着动物的一生［41］，而脂肪的沉积主要由前体脂肪细胞的增殖和分化决定。为了进一步研究m6A对脂肪生成的作用，试验分离了秦川肉牛的前体脂肪细胞，并鉴定了其具有正常增殖和成脂分化的能力，进而在体外开展上述5个基因在前体脂肪细胞增殖和分化中的表达分析。已有研究发现敲低m6A的甲基转移酶复合物METTL3/METTL14/WTAP中的任意一种都会通过降低CCNA2的表达进而抑制细胞周期，减弱脂肪生成［18］。另外，METTL3、METTL14和WTAP被发现促进心肌细胞、平滑肌细胞以及多种癌细胞等的增殖［42-48］。本研究的增殖时序结果发现，METTL3、METTL14和WTAP均在增殖前期表达下降，增殖中后期表达恢复，说明m6A甲基转移酶可能也参与调控牛前体脂肪细胞的增殖。与甲基转移酶的作用相对地，m6A去甲基化酶FTO被发现抑制白血病细胞的增殖［49］，ALKBH5可抑制干细胞以及肿瘤细胞的增殖［50-51］。此外，在脂肪生成方面，有研究发现FTO沉默推迟细胞周期的进程，抑制脂肪形成［17，52］。任倩等［53］的研究表明 FTO 可通过抑制线粒体UPR来缓解小鼠脂肪细胞的凋亡。综合本研究发现的FTO和ALKBH5在牛前体脂肪细胞增殖时序中的表达水平变化明显且与甲基转移酶基因的表达模式明显不同的结果，可以推断这5个m6A修饰相关酶基因可能通过发挥其调控m6A甲基化修饰的作用来参与牛前体脂肪细胞的增殖过程。

脂肪生成除了受前体脂肪细胞的增殖影响外，成脂分化中脂滴的形成和脂肪酸合成与代谢更是起到决定性作用。近年来，关于m6A修饰在畜禽脂肪生成和沉积中的作用机制研究逐渐增多，但主要围绕m6A修饰的两个明星酶基因——METTL3和FTO展开。中科院杨运桂课题组最早发现FTO的m6A去甲基化作用是脂肪生成必需的［15］。其他研究陆续发现FTO可以通过调控自噬［16］、线粒体DNA含量［54］等促进小鼠脂肪积累。在畜禽动物中的研究，Jia等［55］在鸡脂肪中的研究发现，FTO通过介导m6A去甲基化，促进与脂质合成相关的基因表达进而增加甘油三酯（TG）的积累。浙江大学汪以真课题组近些年来围绕METTL3和FTO调控猪脂肪沉积方面的一系列研究发现，FTO通过负调控猪脂肪细胞m6A水平，正调控脂肪沉积［35，56-57］；而METTL3通过正调控m6A甲基化水平，抑制猪脂肪沉积［20，35］。他们的研究中还发现了METTL3和FTO在猪脂肪细胞分化前期增加而中后期下降［35］，这与本研究的结果一致，暗示着METTL3和FTO也对牛的脂肪发育可能具有重要调控作用。与上述研究不同，在奶牛乳腺上皮细胞中的研究发现METTL3正调控乳脂的合成［58］，还有其他研究发现METTL3通过提高靶基因的m6A水平介导其表达进而正调控脂质合成与代谢［19，59］。这些结果不同的研究表明了在不同物种中METTL3和FTO调控脂肪生成的作用和机制可能是复杂且存在差异的。此外，与我们的结果不同，有研究发现FTO在人皮下前体脂肪细胞分化过程中表达下降［60］，而另一项研究却发现FTO在人皮下脂肪细胞以及人脂肪细胞株（SGBS）分化中的表达无明显变化［61］。造成这些不同结果的原因可能是动物品种、细胞来源以及成脂诱导方法的不同导致的。另外3个基因——METTL14、WTAP和ALKBH5在牛前体脂肪细胞分化中表达模式基本一致，都是在分化中期显著上升，而后维持高表达水平，这与脂滴的形成过程呈正相关，暗示其可能正向调控成脂分化。也有研究发现了METTL14促进胚胎干细胞分化［30］和脂肪生成［18］。而关于WTAP和ALKBH5在脂肪生成中的研究较少。本研究揭示了METTL3、METTL14、WTAP、FTO和 ALKBH5在 牛脂肪发育和脂生成中可能发挥的潜在作用，后续还需进一步的试验来探究并验证m6A甲基化修饰以及甲基化酶基因对牛脂肪生成的作用和分子机制。

4 结论

本研究发现m6A甲基转移酶METTL3、METTL14、WTAP，以及m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5，均在成年秦川肉牛体内脂肪组织中的表达均显著高于新生牛，在体外前体脂肪细胞增殖和分化过程中的时序表达也都有着明显的差异表达，表明m6A修饰在牛脂肪发育中可能发挥重要作用且这5个m6A甲基化酶具有调控牛前体脂肪细胞增殖和分化的潜在作用。