多次流产患者血栓前状态相关标志物的检测与分析

刘宁，王超，刘羽，王瑞静，张玉红，张婷，田婷婷，刘梅梅

(哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科，哈尔滨 150086)

血栓前状态(prethrombotic state，PTS)是多种因素引起的凝血和抗凝血系统、纤溶和抗纤溶系统功能失调或障碍的一种病理过程。PTS是血栓形成的风险因素，有研究表明凝血功能异常时子宫胎盘部位血流状态发生改变，局部组织易形成微血栓，导致胎盘纤维沉着、梗死，最终引发流产等各种不良妊娠结局[1]。PTS的相关标志物大致可以分为基因标志物[主要包括凝血因子V(FV)、凝血酶原(FⅡ)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因]和凝血相关指标[包括蛋白C(PC)、蛋白S(PS)及高同型半胱氨酸血症(HHCY)等]。已有诸多研究报道PTS相关标志物的改变参与流产等不良妊娠结局的发生，Brenner[2]研究认为PC或PS缺陷、FV及FⅡ基因突变、HHCY均和流产具有显著相关性；Mierla等[3]研究证实，MTHFR、MTRR、FV、FⅡ和PAI-1的基因多态性可促进血栓形成，进而诱发流产。因此，本研究通过观察发生多次流产(发生2次及以上自然流产)的患者体内上述指标的变化，分析其对多次流产发生的影响，以期为多次流产发生机制的研究提供参考，为临床工作中围生期保健提供新的思路。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2019年12月至2021年5月期间就诊于我院妇产科门诊的324例女性为研究对象。将发生2次及以上自然流产且计划妊娠的女性纳入病例组(193例)，无自然流产史且有过正常生育史、要求完善孕前相关检查的女性纳入对照组(131例)。所有入选者均为汉族且样本采集时均为未孕状态，就诊前7日无抗凝、溶栓及避孕用药史。病例组排除标准：存在夫妻一方或双方染色体异常、女性生殖器官解剖异常、内分泌异常、自身免疫疾病、感染、糖尿病、高血压、肾病和肿瘤等。

二、诊疗方法回顾

1.主要仪器与试剂：NP968全自动核酸提取仪(西安天隆)；G1000型PCR扩增仪(杭州博日)；NanoDrop One微量核酸定量仪(Thermo，美国)；3500DX XL测序仪(ABI，美国)；HCY试剂盒(Ortho-Clinical Diagnostics，美国)；PC和PS活性测定试剂盒(Stago，法国)。

2.样本采集及检测：采集病例组和对照组空腹外周静脉血5 ml，血液样本做好标注，室温静置15 min，收集上清液得血清标本，置于-20℃冰箱保存备用。采用循环酶法检测同型半胱氨酸(HCY)水平，发色底物法检测PC活性，凝固法检测PS活性；并提取DNA通过聚合酶链式反应(PCR)扩增后对PTS相关基因进行Sanger法测序，分析以下位点的基因表型：FV基因1691位点、FⅡ基因20210位点、PAI-1基因675位点、MTHFR基因677和1298位点、MTRR基因66位点。各指标检测严格按照实验操作流程完成。

3.观察指标及判断标准：记录两组患者的年龄、体质量指数(BMI)、HCY水平、PC及PS活性，FⅤ(1691)、FⅡ(20210)、PAI-1(675)、MTHFR(677)、MTHFR(1298)及MTRR(66)位点的基因多态性。

参考新近文献[4-5]中的相关标准，本研究将空腹HCY参考值范围定为：5～15 μmol/L；HCY>15 μmol/L为HHCY。PC参考值：70%～140%；PC<70%为PC缺陷。PS参考值：59%～118%；PS<59%为PS缺陷。

三、统计学处理

结 果

一、两组患者的一般资料比较

病例组患者年龄21～44岁，平均(31.66±4.42)岁；BMI 16.52～27.39 kg/m2，平均值(21.61±2.46)kg/m2；对照组年龄22～42岁，平均(31.00±4.57)岁；BMI 17.21～25.66 kg/m2，平均值(21.58±2.49)kg/m2；病例组HHCY发生率为32.1%，对照组HHCY发生率为25.2%。两组间年龄、BMI和HHCY发生率比较均无显著性差异(P>0.05)，组间具有可比性。两组研究对象均未发现FⅤ(1691)、FⅡ(20210)位点的多态性突变，而PAI-1(675)、MTHFR(677)、MTHFR(1298)及MTRR(66)位点均检测到多态性突变。两组PAI-1(675)、MTHFR(677)、MTHFR(1298)和MTRR(66)位点基因型的理论数值和实际数值进行Hardy Weinberg定律检验，结果提示研究人群符合遗传平衡定律，具有群体代表性。

二、相关资料的单因素分析

对两组患者不同年龄及BMI分布情况、PAI-1(675)、MTHFR(677)、MTHFR(1298)、MTRR(66)位点多态性、HHCY发生情况、PC和PS缺陷情况进行单因素分析，结果显示BMI、PAI-1(675)、MTRR(66)位点多态性在两组中有显著性差异(P<0.05)，可能是发生多次流产的影响因素(表1)。

表1 相关参数的单因素分析[n(%)]

三、Logistic多因素分析

将单因素分析结果中有显著性差异的因素[BMI、PAI-1(675)、MTRR(66)]作为多因素分析变量的第一梯队；考虑到有些因素在单因素分析中虽无显著性差异，但其真实的效应可能被低估或被掩盖，故将纳入标准放宽到P<0.1，再纳入MTHFR(677)和PC缺陷两个因素进行多因素分析。分别对BMI、PAI-1(675)、MTHFR(677)、MTRR(66)和PC缺陷进行赋值(表2)，经Logistic回归分析显示BMI>24 kg/m2、PAI-1(675)位点由5G突变为4G和MTHFR(677)位点由C突变为T可能是发生多次流产的独立危险因素(P<0.05)(表3)。

表2 相关因素赋值表

表3 相关参数的Logistic多因素分析

四、Logistic回归模型的评估

采用受试者工作特征曲线(ROC)对回归模型进行评价，ROC曲线下面积(AUC)为0.664(图1)，灵敏度为54.9%，特异度为70.2%，95%CI为60.5%～72.3%，标准偏差为0.030，说明该模型较为可信。

图1 Logistic回归分析的ROC曲线

讨 论

近年来，凝血和纤溶系统失衡与流产等不良妊娠结局的相关性受到越来越多研究者的关注。PTS的相关标志物包括FV、FⅡ、PAI-1、MTHFR、MTRR基因、PC、PS及HHCY等。有研究报道，多次流产人群中相关抗凝蛋白异常主要与PC和PS缺陷相关[6]；机体中MTHFR、MTRR基因突变以及HCY水平的异常不仅会影响叶酸代谢过程，还与胎儿生长发育及母体凝血功能密切相关[7-8]。本研究以发生≥2次自然流产的患者为研究对象，比较病例组与对照组的一般资料及PTS相关标志物的变化，以期为多次流产发生的原因和具体机制寻找新的思路和依据。

有Meta分析显示，FV基因突变可能是妊娠早期自然流产和胎死宫内的重要原因之一[9]。还有研究认为FV基因突变的妊娠女性早期流产发病率和一般孕妇大致相同[10]。但也有学者对甘肃928例RSA女性开展研究，结果显示在这些女性中并没有检测到凝血因子FV和FⅡ的多态性突变[11]。本研究中亦没有发现受检女性存在FⅤ1691、FⅡ20210位点的多态性突变，尚不能证明FV和FⅡ基因突变在多次流产人群中的分布特征，而且这可能与不同种族、地域的群体中基因分布频率的差异有关；另外，也可能与本研究纳入人群数量有限、样本来源单一有关。

PAI-1是血浆纤溶系统的主要拮抗物之一，其水平变化与PAI-1基因675位点4G/5G多态性密切相关，PAI-1水平过高可引起胎盘微血栓的形成、胎盘血流量降低、胎盘功能不良而导致流产发生[12]。本研究中多因素回归分析提示PAI-1(675)位点多态性是多次流产的独立危险因素(P<0.05，OR=1.508)，即控制其他影响因素后，当PAI-1(675)位点由5G突变为4G，多次流产的发生风险增加为原来的1.508倍，提示PAI-1(675)位点5G突变为4G可能增加多次流产的患病风险。

PC缺陷与PS缺陷在亚洲或非洲裔女性中较为常见，PS是PC活化后抗凝的关键辅助因子之一[13]。有研究证实，当PS和PC缺陷时，机体抗凝机制异常，胎盘血栓形成风险显著增加[14]。此外，有研究表明妊娠期PC和PS的水平波动较大，因此非孕期检测PC与PS水平的结果更为可靠[15]。本研究中经χ2检验结果提示，PC缺陷和PS缺陷对多次流产的发生没有明显影响(P>0.05)，但病例组PS缺陷阳性率(21.8%)有高于对照组(14.5%)的趋势，不能排除纳入样本量有限以及入组病例人群单一的影响，后续需要进一步开展多中心多地区的大样本研究加以验证。

MTHFR基因677位点和1298位点突变会增加自然流产风险[16]。MTHFR(677)位点突变C→T的核苷酸变化，可能使妊娠期胚胎丢失或胎儿死亡的风险增加4倍[17]。本研究结果提示MTHFR基因677位点由C突变为T可能是多次流产发生的独立危险因素(P<0.05)，但未发现MTHFR(1298)位点多态性对多次流产的发生存在显著影响(P>0.05)。这可能与本研究样本量少且来源单一有关，还可能与MTHFR基因多态性存在人种差异和地区差异等[18]有关。

MTRR基因66位点突变同样可引起HCY水平升高，增加血栓形成及流产等不良妊娠结局的发生风险[19]。应用叶酸干预可降低流产发生率，改善不良妊娠状态。本研究结果并未发现MTRR(66)位点多态性对多次流产的发生存在显著影响(P>0.05)。

HCY水平异常和不良妊娠结局密切相关[20]。有研究发现流产患者血浆HCY水平明显高于正常妊娠女性[5]；孕妇发生胎盘病变的情况与HHCY密切相关[21]。但本研究结果并未提示HHCY与多次流产的发生存在明显关联，这可能与国家惠民政策免费发放叶酸及叶酸补充的宣传力度增强有关，本地区育龄期妇女孕前保健意识提高，大部分育龄妇女孕前摄入叶酸足够。

高龄是导致妊娠期女性流产发生的主要原因之一[22]。有研究表明高龄女性流产的发生风险远大于适龄孕产妇[23]。随着生育政策的调整及高龄孕产妇的增加，应高度重视高龄导致的妊娠率下降、胚胎丢失率增高等不良妊娠结局。本研究结果中，尚未发现年龄在对照组与病例组存在显著差异(P>0.05)，但仍不能排除年龄对流产发生的影响。这可能与本研究的样本量不足有关，未来需要扩大样本量进一步研究探讨。

有研究认为BMI的升高与自然流产的风险增加有关[24]，其具体机制可能是肥胖引起的炎症产物增加使卵巢血流灌注减少，卵泡膜细胞摄入胆固醇的减少导致类固醇激素合成的前体物质减少，孕酮合成下降，可能导致流产的发生[25]。本研究中Logistic回归分析结果显示BMI的OR值为3.264，即控制其他因素后，BMI每增加1 kg/m2，多次流产的发生风险增加为原来的3.264倍，因此，合理控制BMI可能减少多次流产的发生风险。

本研究仍存在一些不足之处：首先，研究对象仅为黑龙江省部分地区的汉族女性，在样本多样性方面存在局限性；其次，本研究为回顾性病例对照研究，纳入样本量较小，研究结论可能存在一定偏倚，未来还需进行大样本、多中心的研究加以验证；最后，因考虑到数据的稳定性及尽可能排除混杂因素，本研究未纳入D-二聚体、凝血酶时间及凝血酶原时间等常规参数，仅对病例组和对照组中PTS相关标志物的变化进行了比较，但未对其与流产发生的关系进行深入分析，后续应增加动物实验加以探讨，以期得出更可靠的结论。

综上所述，BMI>24 kg/m2、PAI-1(675)、MTHFR(677)基因位点多态性可能是发生多次流产的独立危险因素。这些指标可能有益于自然流产的尽早诊断及未来的精准干预，但它们参与自然流产发生的具体机制与影响尚不清楚，有待后续更深入的研究加以探讨。