大神堂海域人工鱼礁投放对底泥细菌的影响

王 宇，徐晓甫,2，于 莹，郭 彪，高 燕，张 雪，张博伦，张晶伟

( 1.天津市水产研究所 渔业资源科，天津市海洋牧场技术工程中心，天津 300457；2.自然资源部海洋信息技术创新中心，国家海洋信息中心，天津 300171 )

渤海湾是中国最大的半封闭浅海，曾经是鱼虾蟹重要的产卵场和育幼场[1]。近年来，由于填海造陆、过度捕捞和环境污染等原因，渤海湾的环境和资源受到了极大的破坏[2-3]。为恢复海洋资源环境，天津市实施了一系列资源修复及环境治理措施，主要是增殖放流、伏季休渔和人工鱼礁建设。2009年来，天津市根据海域特点，在汉沽大神堂海域进行了人工鱼礁投放，截至2018年底，共投放钢筋混凝土礁体29 308块，形成礁区8.465 km2[4]。

人工鱼礁造成海域水流、声、光的变化从而引起一系列水化(如营养盐、溶解氧、叶绿素等)和生物的变化(多样性、生物量、食物网等)，经过一段时间可形成独特的人工鱼礁生态系统[5-6]，起到改善海洋环境和诱集海洋生物的作用，是修复海洋生态和增殖渔业资源的重要手段[7-9]。相关研究也表明，天津人工鱼礁建设对资源增殖和环境修复起到了一定的作用，然而，关于人工鱼礁的研究主要集中在水化、渔业资源等方面[10-12]，关于人工鱼礁投放对微生物的影响和机理的研究尚未开展。细菌作为海洋生态系统重要的组成部分，发挥着能量流动、信息传导和物质代谢的作用，是海洋生态系统中的生产者和消费者，对海洋环境的平衡和稳定起重要作用。而且，海洋微生物对环境的变化和人类的活动最为敏感，是环境状态的指示者[13-14]。因此，人工鱼礁区微生物的群落特征和影响因子分析是人工鱼礁建设效果评估必不可少的重要内容之一。笔者开展天津大神堂海域人工鱼礁区、对照区及新投礁区表层底泥细菌的种类、多样性、功能基因及影响因子的相关研究，旨在为探明人工鱼礁对海域的影响机理和效果的研究奠定基础，为优化海洋牧场微生物群落结构和功能提供科学依据，为海洋牧场的科学建设指明方向。

1 材料与方法

1.1 采样地点

天津大神堂海域国家级海洋牧场位于渤海湾西部，紧邻天津大神堂国家级海洋特别保护区，受天津海岸大规模围填海工程和过度捕捞的影响，牡蛎礁区生态系统压力逐年增大，为保护牡蛎礁区的生物资源和环境，天津市于2009年开展了人工鱼礁建设工作，截至2018年底已投放钢筋混凝土礁体29 308块，共计10.87万m3，面积达8.465 km2，海域海水深度基本在10 m以内，形成浅堤型鱼礁生态系统。由于2014年礁区与新投礁区位置较近且礁型一致，更具代表性和可比性，故对大神堂国家级海洋牧场的2014年人工鱼礁投放区、2018年6月投礁区和对照区分别设置5个采样地点，具体位置见图1。于2018年9月中旬用采泥器对表层底泥进行无菌采样，同时对底泥理化因子进行测量。

图1 2018年9月人工鱼礁区、新投礁区及对照区底泥细菌采样站位Fig.1 Sampling site of sediment bacteria in artificial reef area,newly built reef area and control area in September 2018

每个站位用采泥器采集3 kg样本，用15 mL无菌EP管收集3～5 g表层底泥(0～5 cm)用于16S rRNA基因分析，每个站位3个平行。用温度计测量底泥温度。剩余底泥样本用于环境因子测定，所有样品置于冷藏箱中保存后置于-80 ℃冷冻室保存待测。

1.2 环境因子检测

环境因子均按照GB 17378.5—2007《海洋监测规范》中的方法测定[15]。底泥重金属采用ICP-MS测定，硫化物用碘量法测定，总有机碳用重铬酸钾氧化—还原容量法测定，粒径用粒径分析仪测定，总磷用分光光度法测定，总氮用凯氏滴定法测定。

1.3 16S rRNA基因测序

使用CTAB法提取细菌总DNA，并使用NanoPhotometer分光光度计测定DNA浓度以及纯度，然后将DNA溶于TE溶液中-80 ℃保存。

将上述方法提取的各样本细菌总DNA，采用两步PCR扩增方法进行文库构建，将纯化的DNA作为模板，扩增16S rRNA基因序列的V4～V5可变区，通用引物序列为515F(5′-GTGCCAGCMGC CGCGGTAA-3′)和926R(5′-CCGTCAATTCMTT TGAGTTT-3′)。

第一次PCR反应体系：5×Buffer 10 μL，dNTP(10 mmol)1 μL，Phusion 超保真DNA聚合酶1 U，正、反向引物(10 mmol)各1 μL，模板DNA 20～50 ng，补充超纯水至50 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，25个循环。第二次PCR反应体系：5×Buffer 8 μL，dNTP(10 mmol)1 μL，Phusion 超保真DNA聚合酶0.8 U，正、反向引物(10 mmol)各1 μL，模板DNA 5 μL，补充超纯水至40 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，10 ℃保温，8个循环。

用1.2%琼脂糖凝胶电泳对PCR结果进行检测，检测效果较好的样本用体积分数2%琼脂糖凝胶电泳切胶回收，以回收产物为模板进行一次8循环的PCR扩增，将Illumina平台测序所需要的接头、测序引物、标签序列添加到目的片段两端。全部PCR产物采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)进行回收，并用FTC-3000TM Real-Time PCR仪进行荧光定量，均一化混匀后完成文库构建，在Illumina MiSeq 2×300 bp平台上完成测序。

1.4 生物信息学分析

测序得到的原始数据，存在一定比例的干扰数据，为使信息分析的结果更加准确、可靠，首先对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据。

基于有效数据进行运算分类单元聚类和物种分类分析，根据运算分类单元聚类结果，一方面对每个运算分类单元的代表序列做物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。同时，对运算分类单元进行丰度、多样性、韦恩图和花瓣图等分析[16-21]，以得到样品内物种丰富度和均匀度信息、不同样品或分组间的共有和特有运算分类单元信息等。另一方面，可以对运算分类单元进行多序列比对并构建系统发生树，进一步得到不同样品和分组的群落结构差异，通过主坐标分析、主成分分析、非度量多维尺度分析等降维图和样品聚类树进行展示[22-24]。为进一步挖掘分组样品间的群落结构差异，选用t检验、组间差异分析、线性判别分析、相似性分析和多重响应排列程序分析等统计分析方法对分组样品的物种组成和群落结果进行差异显著性检验[25-28]。同时，也可结合环境因素进行主成分分析、冗余分析和多样性指数与环境因子的相关性分析，得到显著影响组间群落变化的环境影响因子[29]。利用PICRUSt软件基于Greengenes数据库对每组最大丰度排名前10位的菌群进行功能注释[30]。

2 结果与分析

2.1 运算分类单元分析

测序比对表明：调查海域9月表层底泥样品共检测到8736个运算分类单元，其中鉴定到种的细菌为360种；鱼礁区底泥细菌聚类到8307个运算分类单元，新投礁区底泥样品读到8164个运算分类单元，对照区底泥读到7405个运算分类单元，3个区域细菌平均运算分类单元为7959个。鱼礁区运算分类单元个数>2018年新投礁区运算分类单元个数>对照区运算分类单元个数，鱼礁区及新投礁区细菌相同运算分类单元为1044个，鱼礁区及新投礁区细菌种类相似性更高(图2)。

图2 各区域细菌运算分类单元韦恩图Fig.2 Venn plot of bacterial operational taxonomic unit (OTU) in each area

2.2 物种相对丰度

变形菌门是渤海湾中丰富最高的菌种，对照区变形菌门、拟杆菌门、浮霉菌门和芽单胞菌门丰度低于其他2个区域，只有厚壁菌门在对照区丰度高于其他2个区域。从属上看，对照区细菌种类明显多于其他2个区域，硫氧化菌(Sulfurovum)丰度显著高于其他2个区域；鱼礁区和新投礁区海洋伍斯菌(Woeseia)和脱硫细菌丰度显著高于对照区。总体来说，对照区排名前10位的细菌种类丰度总和显著高于其他2个区域(图3、图4)。

图3 人工鱼礁区、新投礁区、对照区细菌种类门水平相对丰度Fig.3 Relative abundance map of bacterial species (phylum level) in artificial reef area,newly built artificial reef area and control area

图4 人工鱼礁区、新投礁区、对照区细菌种类属水平相对丰度Fig.4 Relative abundance map of bacterial species (genus level) in artificial reef area,newly built artificial reef area and control area

2.3 多样性指数组间差异性分析

3个取样区域底泥细菌物种平均数、香农多样性指数及组间差异见图5、表2、表3。

表2 3个区域的物种平均数及alpha多样性指数Tab.2 Average number of species and alpha-diversity index in three sampling areas

表3 两两区域的P值Tab.3 P-value between every two areas

3个区域中，底泥细菌物种平均数及组内平均alpha多样性指数(香农指数、辛普森指数、chao1指数、ACE指数)均为：鱼礁区>2018年新投礁区>对照区，对照区与其他2个区域底泥细菌组内alpha多样性指数具有显著差异。2018年新投礁区各站位alpha多样性指数范围较大(图5)，可能由于人工鱼礁的投放改变了礁区的水文环境，对各站位底泥微生物影响较大，造成明显的组间差异。鱼礁区细菌丰度和种类较其他2个区域均较大。

图5 人工鱼礁区、新投礁区和对照区底泥细菌比对物种数和beta多样性指数指数组间差异箱形图Fig.5 Box plot of observed species and beta diversity index in three different groups in artificial reef area,newly built artificial reef area and control area

3个区域细菌群落beta多样性指数的均值、最大值及最小值为：对照区>鱼礁区>2018年新投礁区。这说明新投礁区各站位细菌群落结构差异更小。

2.4 非度量多维尺度分析

非度量多维尺度分析(图6)显示，鱼礁区和新投礁区各站位样品聚集在一起，对照区各站位样品独立聚集在一起。说明样品组内相似性高，鱼礁区和新投礁区样品相似性高，与对照区差异明显。

图6 非度量多维尺度分析Fig.6 NMDS analysis diagram

2.5 组间差异物种分析

线性判别分析值(图7)显示，各区域的特异性细菌种类明显不同，2018年新投礁区差异最显著的细菌种类为厚壁菌门、芽孢杆菌、假单胞菌，鱼礁区标志性细菌种类为δ-变形菌门、γ-变形菌门、脱硫杆菌目及海洋伍斯菌属，对照区标志性细菌为弯曲菌目、交替单胞菌目、冷单胞菌科、硫氧化菌属、发光杆菌属、弧菌和科尔韦尔氏菌。

2.6 功能基因分析

原核分类群功能注释适用于对环境样本的生物地球化学循环过程(特别是碳、氢、氮、磷、硫等元素循环)进行功能注释预测。

原核分类群功能注释分析结果(图8a)显示，对照区底泥细菌群落化能异养及有氧化能异养的功能分组显著高于其他2个区域，发酵功能基因稍高于其他2个区域，而硫酸盐代谢相关功能基因较其他2个区域丰度低。可能是人工鱼礁的投放加快了底泥中硫酸盐的循环，增加了相关功能基因的丰度。

功能基因热图(图8b)显示，3个区域功能基因组成和特异种存在差异。2018年新投礁区主要为人类肠道、人类病原体和硝酸盐代谢等基因。鱼礁区为硫化物代谢功能基因、光能自养型基因，对照区主要为发酵、化能异养、有氧化能异养等基因。2018年新投礁区主要是杆菌，鱼礁区主要是耗氧硫细菌，对照区主要是弯曲菌和弧菌等。

图8 各区域功能基因组成及热图Fig.8 Functional gene composition map and heat map in each region

2.7 环境因子关联分析

环境检测表明，新投礁区粒径较其他2个区域大，而硫化物、总磷、总氮含量相对其他2个区域小(表4)。典型相关分析表明，对3个区域影响最主要的因素为粒径和硫化物，影响鱼礁区细菌群落组成的环境因子主要为总磷，影响新投礁区细菌群落组成的环境因子主要为硫化物(图9)。

表4 各区域沉积物环境因子数据Tab.4 Environment factors of sediment in each site

图9 各站位细菌丰度与环境因子的关系Fig.9 Relationship between bacterial abundance and environmental factors in each site

3 讨 论

细菌在海洋物质循环和能量流动中起到重要的作用，且对海洋环境的变化最为敏感，因此，沉积物细菌群落结构和功能的研究可作为人工鱼礁建设效果评估的重要内容和指标之一。根据文献记载，渤海湾春季和秋季表层底泥细菌丰度高于其他季节，且根据细菌的垂直分布特点，表层10 cm环境微生物丰度和多样性最高，占海洋微生物总量的70%[31]，且相对海水，表层底泥对鱼礁投放的响应更加敏感，因此，选择秋季人工鱼礁系统底泥作为研究对象[32]。

3.1 运算分类单元分析

测序注释分析结果显示，鱼礁区细菌的种类数量最多，其次是新投礁区，可能由于鱼礁的投放促进了礁区的物质循环和能量流动，形成了特定的环境，增多了细菌的种类。9月份沉积物细菌种类多于同一海域7月份(运算分类单元为4380个)，且较其他季节多，与文献记载的渤海湾表层沉积物调查结果一致，也说明样品具有代表性。

3.2 物种相对丰度

物种丰度结果显示，渤海湾沉积物优势菌群主要有变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和浮霉菌门，跟刘鹏远等[33]研究一致。与对照区相比，新投礁区和鱼礁区细菌丰度较高的细菌种类更为集中，可能是因为鱼礁的投放造成了特定的环境改变了特定细菌的生长，造成了底泥细菌多样性和群落结构的差异。

3.3 多样性指数组间差异性分析

鱼礁区的细菌多样性高于新投礁区且显著高于对照区，可能是鱼礁投放改变了水域的环境，增加了礁区水体的流量，改变了礁区的物质循环和能量流动[7]，为细菌的生长提供了营养，从而影响了细菌的群落结构。新投礁区的beta多样性指数最小，对照区最大，说明新投礁区各站位礁体间微生物群落趋于一致，鱼礁投放对底泥微生物种类有很大的影响。

3.4 非度量多维尺度分析

聚类分析结果表明，投礁前，新投礁区细菌群落特征与对照区相似性更高[34]，投礁两个月后，新投礁区细菌群落结构与已投礁区趋于一致，相同的运算分类单元数量也更多。可能是鱼礁投放改变底质环境，随着时间推移形成特定的功能微生物群落。

3.5 组间差异物种分析

鱼礁区标志性细菌种类为δ-变形菌门、γ-变形菌门、脱硫杆菌目及海洋伍斯菌属。其中γ-变形菌在水体沉积环境中分布广泛，参与许多物质的代谢过程，如厌氧情况下氨、硫的代谢[35-36]。δ-变形菌主要作为在厌氧条件下还原硫酸盐的硫酸盐还原菌，参与硫酸盐还原代谢，并且硫酸盐还原菌是参与有机物矿化与污染物降解的重要物质[37]。鱼礁区丰富的变形菌门分布可能暗示了此处含有丰富的硫化合物。新投礁区菌群主要为厚壁菌门和芽孢杆菌，均为好氧异养细菌，一般存在于有机质丰富的环境中。对照区差异物种弯曲菌为易引起人体腹泻的有害细菌，弧菌则是海洋生物体表和肠道的优势菌群，其中一些菌类也可能是致病菌。而对照区的科尔韦尔氏菌为嗜油菌，说明对照区环境有一定的污染。交替单胞菌是异养细菌，在物质代谢中起重要作用。新投礁区差异菌群为假单胞菌，主要为化能有机异养型细菌，有极强的有机物分解能力。而新投礁区差异菌群芽孢杆菌也属于厚壁菌，具有快速降解有机物，减少氨氮、亚硝态氮和硫化氢等有害物质，起到优化环境的作用，为有益菌。

3.6 功能基因分析

环境因子检测表明，新投礁区的硫化物含量最低，说明鱼礁区底质环境良好[38]，可能跟硫酸盐还原细菌含量高有一定关系。调查表明，人工鱼礁的投放导致大量的牡蛎在此附着繁殖，产生了大量的有机物，加快了海域的沉积速率，提高了底泥中硫酸盐的含量，可能使鱼礁区硫酸盐还原菌富集，通过呼吸作用消耗硫化物转化为硫化氢，致使新投礁区及鱼礁区的硫化物的含量比对照区低，也可能导致鱼礁区溶解氧含量较低。新投礁区细菌功能基因则主要为人类肠道、人类病原体和硝酸盐代谢基因，可能会导致该区硝酸盐含量增加，这与底泥检测结果对应。

3.7 环境因子关联分析

典型相关分析表明，海域底泥细菌丰度主要受粒径和硫化物影响。沉积物粒径是沉积环境的基本参数，影响着细菌丰度和群落组成。人工鱼礁投放为牡蛎的附着提供了场所，牡蛎的代谢会在礁区产生大量的细颗粒沉积物，细颗粒沉积物为细菌附着提供了更大的表面积和更多的有机质，为微生物的生长和繁殖提供更多的碳源[39]。研究结果表明，人工鱼礁投放起到水质化学物质和微生物双向调节的作用，与Sun等[40]的研究结果一致。本研究探明了人工鱼礁对底泥细菌群落和功能的影响及相关机理，可为人工鱼礁的效果评估及合理建设提供参考。