桃红四物痛经贴的制备工艺优化

延永，王静，田攀

（商洛学院生物医药与食品工程学院,陕西商洛 726000）

原发性痛经是女性经期前后出现的一种周期性腹部疼痛[1-3]，对患者的正常生活、工作及精神产生较大的影响，严重者会影响生命和生育功能[4-5]。治疗原发性痛经大多直接采用甾体激素类药物或前列腺素拮抗剂[6]，大量使用这类药物会对女性内分泌系统造成不良影响。桃红四物汤是活血化瘀的经典方，以具有强劲破血之力的桃仁、红花为主，用甘温的熟地黄和当归来养血调经、滋阴补肝，芍药滋阴养血，以提补血之力，川芎调畅气血、行气活血，以提活血之功。全方配伍得当，使瘀血祛、新血生、气机畅，具有化瘀生新、标本兼治的显著特点[7]，被推崇为调经之要方。王娇[8]将84例原发性痛经患者随机分为对照组（西医对症治疗）和观察组（桃红四物汤加减治疗）治疗，对照组和观察组总有效率分别为78.57%和95.24%，证明桃红四物汤加减治疗原发性痛经的效果优于西医对症治疗的效果。目前，桃红四物汤的研究大都集中于验证古代配方功效[9-11]，较少探究其制剂类型与方剂配比对药效发挥的影响。贴剂是治疗痛经最直接的方式，具有效率高、使用便捷、利于保存等优点[12-14]。贴剂在治疗原发性痛经这类病症部位较为明确的疾病时所展现出的巨大优势，为改良桃红四物汤的贴剂新剂型提供了理论依据。本研究以探究制剂类型与方剂配比对药效发挥的影响为目的，对制剂成型工艺、基质配方、质量标准、稳定性检测等进行研究，通过单因素试验和响应曲面法优化，以期开发出集疗效好、储存时间长、使用舒适便捷等优点为一体的桃红四物痛经贴，为桃红四物剂型改良提供了方法基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

桃仁采集于商洛市商州区黄沙岭，白芍、当归采集于山阳县漫川关镇，红花、川芎、熟地黄购于商洛市怡康大药房（北新街店）。中药材由商洛学院生物医药与食品工程学院张亦琳副教授鉴定。

1.2 仪器与试剂

TK-12B型透皮实验扩散池、UV-225型紫外分光光度计（大连仪器制造有限公司）、HH-2型恒温水浴锅（常州亿通分析仪器制造有限公司）。

明胶（CP）（郑州富太化工有限公司）、甘油（CP）（河北九星化工产品有限公司）、微粒硅胶（CP）（山东萍聚生物科技有限公司）、氧化锌（CP）（海顺新材料有限公司）、无纺布（山东聚福源包装有限公司）、聚丙烯酸钠（CP）（武汉兴众诚科技有限公司），对照品［苦杏仁苷（批号：110820-201607，纯度>98%）、芍药苷（批号：D1016A，纯度>98%）、 阿魏酸（批号：F103702，≥99.5%）］（AP）（南京源植生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 桃红四物痛经贴的制备

处方组成：红花（9 g）、桃仁（6 g）、川芎（15 g）、熟地黄（10 g）、当归（15 g）、白芍（8 g）。

浸膏的制备：中药粉碎后过100目筛，加入到100 mL的圆底烧瓶中，用3倍比例的纯净水浸泡2 h。随后将体系置于100℃的油浴锅中加热3 h，冷却后，过滤，剩余滤渣重复上述提取过程，将两次得到的滤液合并。转移至圆底烧瓶，水浴90～100℃温度下减压蒸至稠膏状，再加入5倍量体积的甲醇，混匀后静置30 min，待沉淀完全后，取其上清液，减压除去甲醇至稠膏状，即得浸膏（1 mL流浸膏相当于原药材1 g），进而计算浸膏得率。

贴剂的制备：将所需量的明胶倒入烧杯，加入其2倍量的纯净水浸泡30 min至明胶全部溶解，置于60℃恒温水浴锅内加热20 min，再依次加入所需量的甘油、聚丙烯酸钠、氧化锌0.1 g、微粒硅胶0.1 g，搅拌，至初溶液变为乳白色的粘稠状膏体，此时加入桃红四物浸膏1 g，搅拌混合均匀后，趁热涂抹于切割好的无纺布上，要求膏体厚度适中，待膏贴表面盖上保护膜后再取下时不粘着为止，盖上保护膜后，置封口袋中密封，既得桃红四物痛经贴。

1.3.2 桃红四物痛经贴的考察指标与评分标准

以桃红四物痛经贴的累积透皮率、累积释放度、粘着力及赋形性作为评价指标对痛经贴进行打分，权重比为 3：3：2：2，计算各项评分的总和。评分指标如表1所示。

表1 桃红四物痛经贴的评分指标

透皮率试验：取体重为100～105 g的健康大白鼠，脱颈椎处死后，去毛后剥取完整皮肤，除去皮下脂肪和结缔组织，分别用蒸馏水、生理盐水冲洗干净后，裁剪成3 cm×3 cm规格，外侧贴覆试验样品，固定于透皮扩散池上（皮肤样品内侧朝向扩散液），在池内注满扩散液（30%乙醇），于（32±1）℃，300 r/min 条件下进行试验。分别于 1，2，4，6，8，10 h从取样口吸取扩散液1 mL，并补充相同体积的30%乙醇溶液。采用《中国药典》方法[15]，分别测定苦杏仁苷、阿魏酸、芍药苷的含量，计算Q累积透皮率。

式中，Cn为第n个取样点测得成分质量浓度，Vn为接收室中溶液体积，Ci为第i(n-1)个取样点测得成分质量浓度，Vi为取样1.0mL，A为有效渗透面积。

释放度试验：以Franz扩散池为释放装置，将透析膜固定于供给池和接收池之间，将痛经贴剪成面积2.5 cm2的圆形小片，紧密贴于半透膜上，释放接收液为生理盐水，体积6.4 mL，温度（37±1）℃，搅拌速度 300 r/min，分别于1，2，4，6，8，10 h 取样，每次1 mL，同时补加1 mL生理盐水，0.22 μm的微孔滤膜过滤后，采用《中国药典》方法[15]，分别测定苦杏仁苷、阿魏酸、芍药苷的含量，计算Q累积释放率。

式中，Cn为第n个取样点测得药物质量浓度，Vn为接收室中溶液体积，Ci是第i（n-1）个取样点测得成分质量浓度，Vi为取样1.0 mL，W为痛经贴中的各有效成分含量。

粘着力：将桃红四物痛经贴在18～25℃、相对湿度40%～70%的环境下放置2 h取出后，揭掉其保护膜，粘着面向上后固定在倾斜板中央。然后从斜面上部将9 mm不锈钢球连续滚落5次，记录在检测处粘住次数。

赋形性：将桃红四物痛经贴在37℃和相对湿度64%的环境中放置1 h取出后，固定在平整且与水平面保持60°的钢板上24 h，对膏面进行评价。

1.4 单因素试验设计

前期研究发现，粘着剂明胶、保湿剂甘油和表面活性剂聚丙烯酸钠对痛经贴综合评分和质量影响较大，故选这三种辅料做单因素试验。基质基础配方为：聚丙烯酸钠（0.25 g）、甘油（1.5 mL）、氧化锌（0.1 g）、微粒硅胶（0.1 g）、明胶（0.2 g）。 在其他条件不变的情况下，分别调整明胶质量为0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 g，甘油体积为 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，聚丙烯酸钠的质量为 0.15，0.20，0.25，0.30，0.35 g，测试明胶、甘油、聚丙烯酸钠质量对桃红四物痛经综合评分及质量的影响。

1.5 响应面试验优化

单因素试验结果得到三个单因素的三组最佳水平，根据Design-Expert 8设计软件，按照响应面法的设计，以痛经贴的累积透皮率、累积释放度、粘着性及赋形性等指标的综合评分为响应值，进行响应面试验优化。因素水平如表2所示。

表2 响应面试验优化的因素水平

1.6 验证试验

对响应面优化的试验结果，重复三次，放大10倍、20倍测试，检查新工艺得到桃红四物痛经贴的累积透皮率、累积释放度、粘着力、赋形性等指标的综合评分，验证该工艺制备桃红四物痛经贴的稳定性。

1.7 桃红四物痛经贴的质量检查

随机选取的10片桃红四物痛经贴，分别称量单片重量，进行重量差异检查；分别将桃红四物痛经贴放置在高温、高湿环境（温度：40℃，湿度：85%～90%）和室温（温度：25℃，湿度：55%～60%）放置30 min，对其进行含膏量、重量差异、含量测定的检查。含膏量检查、有效成分（苦杏仁苷、阿魏酸、芍药苷）含量测定采用《中国药典》方法[15]。

2 结果与分析

2.1 桃红四物提取浸膏得率

将1.3.1中经二次煎煮提取药液256 mL浓缩后，得流浸膏47.82 g，浸膏得率为18.62%，浸膏得率较高、质量较好。说明通过二次煎煮可以高效提取桃红四物各药材的主要成分，煎煮提取方法适用于桃红四物复方制剂的制备。

2.2 桃红四物痛经贴制备工艺优化单因素试验

单因素试验对桃红四物痛经综合评分结果见表3，随着明胶质量的增多，桃红四物痛经贴的综合评分明显上升；但明胶质量增加到一定程度，再增加明胶质量，桃红四物痛经贴的有效成分累积释放度、累积透皮率及赋形性等指标变差，从而导致综合评分降低。可能原因是过多的加入明胶会导致桃红四物痛经贴流动性和涂抹性变差。因此，选用明胶质量为0.15，0.20，0.25 g作为响应面的试验水平。甘油体积的增加，在一定范围内会使桃红四物痛经贴的综合评分出现上升现象，但甘油体积增加到一定程度，再增加甘油体积，桃红四物痛经贴的粘度会急剧降低，使得桃红四物痛经贴的粘度系数大幅度减小，综合评分降低。因此，选择甘油体积为1.0，1.5，2.0 mL作为响应面试验的三个水平。聚丙烯酸钠质量对桃红四物痛经贴的综合评分影响与甘油相似。适量的聚丙烯酸钠有利于提升桃红四物痛经贴的粘度和涂抹性，同时不会对有效成分的累积透皮率和累积释放度产生较大的影响。但过多的加入聚丙烯酸钠会导致流动性变小、粘度增大，使其赋形性和有效成分的累积透皮率及累积释放度降低，影响综合评分。因此，选用聚丙烯酸钠质量为0.25，0.30，0.35 g响应面试验的三个水平。

2.3 桃红四物痛经贴制备工艺响应面法优化

根据单因素试验得到最佳因素水平，进行Box-Benhnken中心组合的试验设计，以桃红四物痛经贴的累积透皮率、累积释放度、粘着性及赋形性等为指标进行综合评分为响应值，响应面试验设计方案及结果见表4。

表4 桃红四物痛经贴制备工艺响应面法优化试验结果

表5可见，所建立的多元回归模型差异显著（F=36.9＞1，P＜0.000 1）， 模型失拟项不显著（P=0.056 3＞0.05），说明该模型能够对优化的工艺进行真实模拟。其决定系数R2=0.979 4，测量信噪比为14.724，说明该模型的契合度足够好，各因素的变异概率较低，且因素选择合理。从各因素对桃红四物痛经贴综合评分影响的F值大小可判断，各因素对桃红四物痛经贴综合评分影响的顺序为：B（甘油体积）＞C（聚丙烯酸钠质量）＞A（明胶质量）。根据软件模拟模型预测综合评分回归方程为：Y=88.32 －0.3125A+0.8B －0.4875C －0.225AB －0.1AC+0.2250BC－5.84A2－1.46B2－1.63C2。 预测最优工艺的配料比为：明胶0.20 g、甘油1.64 mL、聚丙烯酸钠0.30 g，综合评分为88.43分。

图1是该模型模拟的明胶、甘油、聚丙烯酸钠的含量对桃红四物痛经贴综合评分影响趋势的响应面，在模拟的响应面图形上，有明显的凸起，说明在该模型模拟的综合评分的响应面可以预测出综合评分的最大值。由图1（a）和图1（b）可见，明胶质量对综合评分的影响最大，随着明胶质量的增加，桃红四物痛经贴的综合评分显著提高，但过量的明胶会导致桃红四物痛经贴流动性和涂抹性变差，对其有效成分累积释放度、累积透皮率和赋形性综合评分产生明显影响，体现在响应面上就是明胶对应的一侧坡度最陡。响应面底部是各因素对桃红四物痛经贴综合评分的等高线，等高线的形状可反映两个因素的交互作用。由图1所示，各因素相互作用的等高线形状为明显的椭圆形，说明各因素之间有一定的交互作用。

图1 各因素两两交互对桃红四物痛经贴综合评分的影响

2.4 桃红四物痛经贴制备工艺的验证

经验证，桃红四物痛经贴的综合评分为89.12分（RSD＝51.98%），与预测产率基本一致。对工艺放大10倍，20倍进行试验，所制得贴剂与小试结果基本一致。验证结果说明本研究模拟的模型准确可行，优化出桃红四物痛经贴工艺具有很好的稳定性。

2.5 桃红四物痛经贴的质量检查

桃红四物痛经贴平均重量为3.515 g，重量差异在±1%以内，贴剂较为轻盈，使用舒适。含膏量平均值为5.813 g/100 cm2，经测定，单个贴剂中苦杏仁苷、阿魏酸、芍药苷的含量分别为5.31%，0.68%，1.38%，单片贴膏有效成分含量越多，一定范围内越有利于提升贴剂疗效。将桃红四物痛经贴分别置于高温、高湿环境（温度：40℃，湿度：85%～90%）30 min，桃红四物痛经贴各项指标变化在5%以内，制备的桃红四物痛经贴性质较稳定，各项指标均符合贴剂标准[15]。

3 讨论与结论

本研究以桃红四物汤为基础，对常用于凝胶膏剂的基质配料比进行改良优化，研制出一款对于原发性痛经治疗效率较高的桃红四物痛经贴。具体工艺配方为：桃红四物浸膏1.0 g，明胶0.20 g，甘油1.64 mL，聚丙烯酸钠0.30 g，氧化锌0.1 g，微粒硅胶0.1 g，水0.4 g。经验证，制备的桃红四物痛经贴平均重量为3.515 g，重量差异限度在±1%以内。膏面整体光洁平滑、无多余颗粒物、气泡和残留物。粘度适中、使用时不易脱落。含膏量较大，含膏量平均值为5.813 g/100 cm2，且高温、高湿环境比较稳定。该工艺可根据实际制备需求放大。

秦岭是我国重要的野生中药资源宝库[16]。据统计，仅陕西省的秦岭区域内可入药的天然草药植物就达到3 210种[17]，其中，不乏大量可用于有效治疗痛经，活血养血的珍贵药草。由红花、桃仁、川芎、熟地黄、当归、白芍配伍而成的桃红四物汤被誉为养血祛瘀、温经止痛的经典名方，对女性痛经具有标本兼治的疗效。本研究通过对桃红四物痛经贴剂的制剂成型工艺、基质配方、质量标准、稳定性检测等的研究，创新性开发出桃红四物汤的贴剂新剂型，实现了桃红四物药汤的体外实施，能有效地避免药物分子与生物效应对机体的刺激伤害，减少副作用，具有给药直接、方便实施、安全稳定等特点[18-20]，解决汤剂煎药过程繁琐、储存困难的难题，有效提升了患者的依从性。桃红四物汤成分复杂，与同类型化学药物的研究和开发相比较具有更大的难度，本研究将西药中普遍开展的药物传输系统研究应用于中药制剂的开发过程，创新性将桃红四物有效成分的累积释放度、累积透皮率引入新剂型的评价体系中，有效克服了贴剂受底物活性成分受分子量、亲水/亲油性和熔点等因素影响较大的弊端，为发展桃红四物新剂型、新产品提供新的研究思路，推动了中药事业的不断进步。在后续研究中，应着重关注中药贴剂体外药物释放、汤剂体内药物释放与治疗效果的差异，开展不同剂型、不同处理方式、不同用药位置治疗效果产生影响的作用机制研究[21-22]，不断规范治疗程序，为贴剂药效发挥、提升治疗效果提供临床依据。