YAP和TAZ在宫颈癌中表达及临床意义

曲长萍 田君 王宁 霍会蚕 卢慧芳

(河南大学淮河医院妇产科，河南 开封 475000)

子宫颈癌是威胁妇女健康的第四位恶性肿瘤，据统计，全球年新发病例约60.4万例，死亡约34.2万例〔1〕。在发达国家，行之有效的筛查方案及人乳头瘤病毒(HPV)疫苗的普及将宫颈癌的发生率和死亡率减半，调查结果显示目前约85%的新发病例及90%的死亡病例发生在经济欠发达地区〔2，3〕。高危型HPV持续感染是宫颈癌发生的始动因素〔4〕。80%的女性一生中至少感染过一次HPV，但发展为宫颈癌的风险不到1%〔5〕，因此单纯HPV感染不足以使宫颈上皮细胞发生恶性转化及无限增殖，由此，针对宫颈癌发生的相关分子机制一直都是研究的热点。Hippo信号通路与人类多种恶性肿瘤有关，且与肿瘤的恶性表型及患者预后密切相关〔6〕,Yes相关蛋白(YAP)与转录共激活因子PDZ结合基(TAZ)是Hippo通路下游的主要效应因子，作为细胞外应力作用调控细胞命运的关键核转导因子，二者在调节组织再生及肿瘤的发生发展中起重要作用〔7〕。本研究探讨YAP/TAZ蛋白在宫颈癌组织中表达及二者与宫颈癌患者预后的关系。一是为Hippo信号通路参与宫颈癌的发病机制提供一定的参考依据，二是为寻找宫颈癌新的肿瘤分子标记物及潜在的治疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1临床样本收集 选取2020年1月至2021年12月河南大学淮河医院妇科行手术治疗的宫颈癌患者98例，其中65例病理诊断为宫颈癌并行广泛全子宫切除+盆腔淋巴结清扫术的患者。其中鳞癌57例，腺癌8例；宫颈癌分期采用国际妇产科联盟(FIGO)2018年的诊断标准，其中Ⅰb2期13例，Ⅱa1期35例,Ⅱa2期17例；按肿瘤分化程度分为高分化10例，中分化36例，低分化19例；根据病理证明盆腔淋巴结转移为有转移22例，无转移43例。对照组33例选自同期因子宫良性病变(子宫平滑肌瘤、子宫腺肌病等)行子宫全切术的正常宫颈标本，术前HPV检测阴性，术后病理证实无宫颈病变。宫颈癌组年龄33～71岁，平均54.15岁，对照组年龄34～57岁，平均52.58岁。排除标准：合并其他恶性肿瘤、急性生殖道感染或其他严重疾病、就诊前接受放化疗等特殊治疗、精神异常或有沟通障碍，临床及病理资料完整。所有参加本研究对象或其法定代理人自愿接受此项研究并签署知情同意书，并已通过医院医学伦理委员会审批。

1.2试剂与方法 主要试剂：兔抗人YAP多克隆抗体(APR10774G)、兔抗人TAZ多克隆抗体(APR10378G)均购自Proteintech公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠通用二抗(ab97040)购自DAKO公司；组化试剂盒二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3检测YAP、TAZ的表达 兔抗人YAP多克隆抗体、兔抗人TAZ多克隆抗体均以1∶600稀释。免疫组化SP法参照试剂盒说明书操作，包括脱蜡、水化，抗原修复，3% H2O2孵育5～10 min，3%牛血清白蛋白(BSA)血清封闭，滴加一抗37℃孵育1 h，二抗37℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水、二甲苯透明、封片等。

1.4结果判断 采用免疫组化法检测YAP和TAZ蛋白的表达情况，结果判读〔8,9〕由2名病理科医师独立完成，共同商议最终结果，YAP和TAZ均表达于细胞核和细胞质，阳性细胞染色为棕黄色，根据染色强度和阳性细胞数目计分，染色强度：不染色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；阳性细胞<25%为0分，25%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分；两者乘积为最终结果：0～1分为阴性表达，2分及以上为阳性表达。

1.5统计分析 使用SPSS20.0进行χ2检验及秩和检验。

2 结 果

2.1YAP在宫颈癌组织与正常宫颈组织中表达 YAP在宫颈癌组织中表达于细胞核和细胞质，呈棕黄色颗粒状，在正常宫颈组织中不表达(图1)。宫颈癌组YAP阳性表达率〔54例(83.07%)〕与正常组〔7例(21.21%)〕差异有统计学意义(Z=-5.940，P=0.000)。

2.2TAZ在宫颈癌组织与正常宫颈组织中表达 TAZ在宫颈癌组织中表达于细胞核和细胞质，呈棕黄色颗粒状，而在正常宫颈组织中很少表达或不表达(图1)。宫颈癌组TAZ阳性表达率〔49例(75.38%)〕与正常组〔4例(12.12%)〕差异有统计学意义(Z=-5.909，P=0.000)。

宫颈癌组YAP

2.3YAP和TAZ表达与宫颈癌患者临床特征的关系 YAP阳性表达与组织浸润深度、组织分化程度、淋巴结转移和FIGO分期有统计学意义(P<0.01)；TAZ与组织分化程度、淋巴结转移和FIGO分期有统计学意义，而二者与年龄因素无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 YAP和TAZ阳性表达与宫颈癌患者临床特征的关系(n)

3 讨 论

Hippo信号通路是最先在果蝇里通过遗传筛选发现的〔10〕，该通路是1条由一系列蛋白激酶和转录因子组成的激酶链，YAP/TAZ是该通路的主要效应器，可调控组织稳态、器官大小、组织再生和肿瘤进展〔11〕，以可控的方式穿梭于细胞核和细胞质〔12〕。Hippo通路处于激活状态时，会磷酸化YAP/TAZ蛋白，从而保持细胞的自我更新与凋亡之间的平衡，当Hippo通路失活时，去磷酸化的YAP/TAZ蛋白会打破这个平衡，因此Hippo通路的失控导致细胞和器官的过度生长，突显了其在癌症生物学中的重要意义〔13，14〕,目前已知，YAP/TAZ蛋白在直肠癌〔14〕、乳腺癌〔15〕、胃癌〔16〕、肾癌〔17〕等恶性肿瘤中呈过表达,并且与癌症患者低生存率呈正相关。因此，YAP/TAZ这两种转录激活因子的抑制剂可能被用于癌症的治疗。

高危型HPV16和HPV18相关宫颈癌占宫颈癌总数的70%以上〔18〕。而HPV基因的2个早期基因区的E6和E7基因在细胞癌性转化过程中发挥着关键作用，是病毒致癌的主要驱动力，除了它们很好地抑制了p53和pRb肿瘤抑制基因的失活外，还调节部分基因转化的信号通路〔19，20〕。研究表明，YAP表达与HPV感染有关，HPV E6蛋白可抑制YAP蛋白降解，HPV E7蛋白通过靶向PTPN14促进YAP蛋白在细胞核中的表达，HPV E6/E7诱导的YAP蛋白累积并释放至细胞核，这可能是通过Hippo通路促进宫颈上皮细胞增殖并导致癌变的机制〔21，22〕。因此，HPV可通过诱导Hippo-YAP/TAZ通路中YAP的激活共同促进宫颈癌的发生发展。

He等〔23〕研究显示，69例宫颈癌YAP的强阳性表达高达71.88%，弱阳性表达率为18.80%。Xiao等〔24〕的研究显示，免疫组化法研究YAP在10例宫颈炎标本、104例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ～Ⅱ及34例宫颈鳞癌标本中表达情况，在慢性宫颈炎标本细胞质中YAP呈阴性或弱表达，宫颈癌组织较CIN组织中YAP的表达较强。另外在一个样本量194例宫颈癌标本中的研究显示，TAZ阳性表达率为84.54%〔25〕。本研究结果与上述研究相符。

张雯等〔26〕通过免疫组化法和细胞转染及干扰实验对80例宫颈癌标本的研究显示，Hippo通路最主要的激酶组分大肿瘤抑制基因(LATS)1蛋白在45%的宫颈癌组织中低表达，LATS1的低表达与FIGO分期及肿瘤分级呈正相关，提示LATS1表达下调与宫颈癌肿瘤发展进程相关。因LATS1/2是激酶级联反应链中的作用元件，是YAP的上游调控因子，磷酸化的LATS1/2与Mps-结合者激酶激活因子(MOB)1形成LATS1/2-MOB复合物，进一步促进YAP、TAZ发生磷酸化，而当LATS1表达下调，YAP/TAZ去磷酸化核转位后与转录因子TEA结构域转录因子(TEAD)1～4结合形成转录复合体，从而促进细胞增殖、分化、抑制凋亡等〔27〕，Sun等〔28〕研究表明通过敲除LATS1基因，增加了YAP积累，促进原发性肝癌的迁移和侵袭，这与YAP调节有关。Li等〔29〕研究发现许多微小RNA通过抑制LATS1/2的转录，增加YAP的活性，从而促进胃癌细胞的侵袭和耐药能力。Li等〔30〕发现通过增强YAP信号转导促进胰腺导管腺癌生长，并且YAP过表达与其预后不良因素相关。本研究进一步证实了YAP/TAZ在宫颈癌组织中高表达，且与宫颈癌不良预后相关。同时揭示了YAP与TAZ同为Hippo信号通路中同源辅助转录因子的协调作用，共同促进宫颈癌的发生发展，今后深入探究其调控机制和信号转导通路，将为宫颈癌患者预后的评估及寻找治疗的潜在药物靶点提供依据。