过氧甲酸预处理对甘蔗渣酶解和发酵的影响

李 宁, 孟繁阳, 杨海艳,2, 史正军,2, 赵 平,2, 杨 静,2*

(1.西南林业大学 化学工程学院,云南 昆明 650224; 2.云南省高校特色林木生物质资源化学利用重点实验室,西南林业大学,云南 昆明 650224)

能源短缺和环境恶化使得寻求一种清洁、可再生的绿色能源成为我国基础工业领域的重要任务之一。据统计，全球的生物质年产量约 1 100 亿吨，其中木质纤维原料(如农林剩余物的秸秆、木屑和工业废弃物甘蔗渣等)占生物质资源总量的 80%以上[1]。合理利用废弃的木质纤维原料对解决能源和环境问题起着重要的作用。甘蔗渣是制糖工业的副产物，其成分纤维素、半纤维素可被水解为单糖，继而发酵成为燃料乙醇[2-3]。然而木质纤维中的纤维素、半纤维素和木质素会相互包裹形成致密结构的物理屏障，且木质素与半纤维素会形成木质素-碳水化合物复合物(LCC)，使得三大组分难以分离，无法高值化利用[4]。对生物质进行预处理是除去这种天然抗降解屏障的有效方法[5]。预处理可以降低纤维素的结晶度，增加木质纤维原料的多孔性，脱除木质素和半纤维素的保护作用，增加木质纤维酶解过程中酶与木质纤维的可及性，从而提高后续的酶解效率。目前甲酸法脱木质素已经比较常见，但仅用甲酸脱木质素并不是最佳的选择，因为随着甲酸浓度的提高，木质素的缩合反应会增加，大量的碳水化合物被降解，影响后续酶解葡萄糖得率[6]。而相较甲酸预处理，过氧甲酸预处理酸性更强，在温和条件下即可脱除大量木质素，提高酶解得率[7]。本研究对甘蔗渣先进行过氧甲酸预处理，然后经酶解后进行发酵，研究预处理对甘蔗渣酶解和乙醇得率的影响，以期为木质纤维高值化利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘蔗渣(SCB)，购于云南孟连昌裕糖业有限公司，粉碎至0.250～0.380 mm，备用。纤维素酶(Cellic CTec2)，购于美国Sigma公司，其滤纸酶活250 FPIU/mL，β-葡萄糖苷酶酶活71.54 IU/mL；酵母膏(生物试剂)，北京奥博星生物技术有限公司；酿酒酵母(高活性干酵母)，安琪酵母股份有限公司；考马斯亮蓝，广州赛国生物科技有限公司；过氧化氢(HPP)、甲酸(FAP)、葡萄糖等均为市售分析纯。

Agilent 1260高效液相色谱仪，美国Agilent Technologies公司；KX-500A粉碎机，浙江武义鼎藏日用金属制品；TDL-5-A低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；Micromeritics ASAP系列比表面积分析仪，上海 Micromeritics公司；THZ-98C恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司；D/MAX 2500PC型X射线衍射仪，日本Rigaku公司；TU-1901双光束紫外可见分光，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 甘蔗渣的过氧甲酸预处理

分别取SCB 10 g，按固液比1 ∶15(g ∶mL)加入不同浓度的过氧甲酸(HPP与FAP体积比为1 ∶1、 1 ∶4和1 ∶8)，室温(25±2) ℃条件下反应2 h，然后用蒸馏水洗涤至中性，分别命名为PAP-SCB-1、PAP-SCB- 4和PAP-SCB-8。单独FAP和HPP预处理的SCB作为对照样，命名为FAP-SCB、HPP-SCB。

1.3 甘蔗渣的纤维素酶水解

取预处理后的SCB 1 g，加入适量自制的0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(另含0.093 mol/L NaOH)调节 pH 值至4.8，纤维素酶用量为 10 FPIU/g(以预处理后甘蔗渣质量计)，水解体系为20 mL,在50 ℃、 150 r/min条件下水解72 h。水解液离心去除固体残渣后得上清液，于高压灭菌锅121 ℃灭菌 30 min，冷却备用。

分别于2、 4、 6、 10、 24、 48和72 h时取少量水解上清液进行稀释[8]，采用高效液相色谱(HPLC)仪测定其糖组分， Bradford法[9]测定其游离纤维素酶蛋白含量。葡萄糖和木糖得率按文献[10]的方法计算，见式(1)和式(2):

Y1=(C1×0.9×0.02)/(m×ω1)×100%

(1)

Y2=(C2×0.88×0.02)/(m×ω2)×100%

(2)

式中:Y1—葡萄糖的得率，%；C1—水解液中葡萄糖质量浓度，g/L； 0.9—纤维素和葡萄糖的转化系数； 0.02—水解液的体积，L；m—SCB的质量，g；ω1—SCB中纤维素的质量分数，%；Y2—木糖得率，%；C2—水解液中木糖质量浓度，g/L； 0.88—半纤维素和木糖的转化系数；ω2—SCB中半纤维素的质量分数，%。

1.4 甘蔗渣水解后上清液的发酵

按0.05 g/mL称取葡萄糖若干，按0.1 g/mL称取酵母膏适量，将两者混合，加入0.216 g酿酒酵母，35 ℃活化30 min，制备成8 mL的酵母溶液。取4 mL1.3节水解72 h后的水解上清液，加入0.5 mL酵母溶液，35 ℃ 发酵24 h[11]。使用高效液相色谱仪测定发酵液中乙醇质量浓度，并计算乙醇得率。乙醇得率按文献[12]的方法计算，见式(3):

Y=C/(CG×0.51)×100%

(3)

式中:Y—乙醇得率，%；C—乙醇质量浓度，g /L；CG—发酵液中葡萄糖初始质量浓度，g/L； 0.51—葡萄糖转化乙醇的理论值。

1.5 分析测定

1.5.1物料组分测定 甘蔗渣预处理前后的主要成分(葡萄糖、木聚糖、木质素和纤维素)测定根据国家标准方法分析[13]。固体回收率、纤维素回收率和木质素脱除率按式(4)～式(6)计算。

η0=m′0/m0×100%

(4)

η=m′1/m1×100%

(5)

φ=(1-m′2/m2)×100%

(6)

式中:η0、η—分别为固体和纤维素回收率，%；φ—木质素脱除率，%；m′1、m′2—分别为预处理甘蔗渣中纤维素和木质素质量，g；m′0、m0—分别为预处理和未处理甘蔗渣质量，g；m1、m2—分别为未处理甘蔗渣中纤维素和木质素质量，g。

1.5.2蛋白质浓度测定 采用 Bradford 法[9]测定预处理甘蔗渣酶水解上清液中蛋白质浓度。取0.1 mL 水解上清液加入2 mL考马斯亮蓝溶液，室温下反应5 min，595 nm下测定紫外吸光值，以同样方法处理蒸馏水作为对照，根据标准曲线计算样品蛋白质浓度。

1.5.3比表面积测定 采用BET法(氮吸附法)[14]测定预处理后甘蔗渣的比表面积。

1.5.4X射线衍射分析 采用X射线衍射(XRD)仪对预处理甘蔗渣进行分析[15]。预处理甘蔗渣经照射后，内部定型或无定型结构会发生衍射而产生不同特征峰，通过结晶峰面积与总面积的比率可计算出其内部纤维素结构变化，计算方法见式(7)：

Ic=(I002-Ia) /I002×100%

(7)

式中:Ic—结晶度指数，%；I002—2θ为22.5°对应的002晶面的最大衍射强度；Ia—2θ为16°对应的非结晶背景衍射强度。

2 结果与分析

2.1 过氧甲酸预处理对甘蔗渣化学成分和结构特征的影响

2.1.1甘蔗渣化学成分 甘蔗渣(SCB)在室温(25±2) ℃下，经不同浓度过氧甲酸预处理2 h后的化学成分变化如表1所示，实验以甘蔗渣原料、单独过氧化氢预处理甘蔗渣(HPP-SCB)、单独甲酸预处理甘蔗渣(FAP-SCB)为对照组进行对比分析。

从表1可知，SCB含葡聚糖、木聚糖和木质素分别为46.36%、 22.51%和21.27%。经单独过氧化氢和单独甲酸预处理后，木聚糖含量没有明显变化，但木质素的量降低，HPP-SCB和FAP-SCB的木质素脱除率分别为10.06%和12.55%。甘蔗渣经不同体积比(V(HPP) ∶V(FAP)分别为1 ∶1，1 ∶4和1 ∶8)的过氧甲酸预处理后，尽管木聚糖含量未发生明显变化，但木质素均低于10%。当V(HPP) ∶V(FAP)为1 ∶1时，预处理甘蔗渣(PAP-SCB-1)中木质素的量为3.34%，木质素脱除率为84.30%，相比过氧化氢单独预处理和甲酸单独预处理分别提高了74.24和71.75个百分点，木质素的脱除有利于甘蔗渣的后续酶解糖化过程。由表1中数据可以看出，随着过氧甲酸中过氧化氢比例的降低，木质素脱除率降低，可能是因为甲酸浓度的增加，甘蔗渣表面的木质素会发生缩聚，从而导致PAP-SCB- 4中木质素含量较PAP-SCB-1略微增加[16]。Bu等[17]研究发现，进行过氧甲酸预处理，甘蔗渣中纤维素损失很小(9.20%)，木质素被显著去除(59.00%)，且预处理甘蔗渣获得了完全糖化。

表1 不同浓度过氧甲酸预处理对甘蔗渣化学成分的影响1)

1)SCB:未处理甘蔗渣untreated sugarcane bagasse; HPP:过氧化氢预处理hydrogen peroxide pretreatment; FAP:甲酸预处理formic acid pretreatment; PAP-SCB-1、PAP-SCB- 4、PAP-SCB-8:分别采用过氧化氢与甲酸体积比1 ∶1、 1 ∶4和1 ∶8的比例对甘蔗渣进行预处理 pretreatment of bagasse with volume ratio of hydrogen peroxide to formic acid of 1 ∶1, 1 ∶4 and 1 ∶8, respectively; 下同the same as in the following

2.1.2比表面积分析 甘蔗渣经不同浓度过氧甲酸预处理2 h后的BET比表面积测定结果如图1所示。甘蔗渣经过氧化氢单独预处理和甲酸单独预处理后，其比表面积从未处理的0.09 m2/g(SCB)增至1.141 8 m2/g(FAP-SCB)和1.220 1 m2/g(HPP-SCB)，这表明无论是过氧化氢还是甲酸均可溶出甘蔗渣中的少量木质素，使得甘蔗渣孔隙度增大，从而比表面积增大。由图1还可以看出甘蔗渣经过氧甲酸预处理后，比表面积明显增加。PAP-SCB-1比表面积增至13.01 m2/g，分别是HPP-SCB的10.66倍和FAP-SCB的11.39倍；当过氧甲酸中甲酸用量增加时，预处理后的甘蔗渣比表面积下降明显，PAP-SCB- 4和PAP-SCB-8的比表面积仅分别为6.36和3.23 m2/g。这是因为过氧甲酸预处理脱除甘蔗渣中的大量木质素，使得甘蔗渣比表面积大大增加，进而可使甘蔗渣与纤维素酶接触面积增大，酶可及度提高。Wu等[18]研究也发现竹材经结构改性，其木质素的脱除可使物料比表面积增大。

2.1.3XRD分析 除了木质素的阻碍作用，纤维素结晶度也是影响木质纤维酶解糖化的重要因素。甘蔗渣经不同浓度过氧甲酸预处理2 h后的XRD分析结果如图2所示。

2θ为22.5°出现的高峰为纤维素晶面指数002的衍射峰，2θ为16°处的衍射峰代表甘蔗渣的无定型区部分，包括无序纤维素、半纤维素和木质素[19]。由图可知，未处理甘蔗渣结晶度为42.64%，经HPP单独预处理和FAP单独预处理后，结晶度增加至48.86%和47.19%，结合表1化学成分结果，分析可知主要原因是少量木质素被脱除，无定型区部分溶解，但未对纤维素结晶区造成破坏[20]。甘蔗渣经不同浓度的过氧甲酸预处理后，结晶度进一步提高到54.18%(PAP-SCB-1)、 52.44%(PAP-SCB- 4)、 52.39%(PAP-SCB-8)，但甘蔗渣结晶指数未随着过氧甲酸中过氧化氢用量的变化而变化，这表明经过氧甲酸预处理后甘蔗渣中虽然大量木质素被脱除了，但过氧甲酸只作用于甘蔗渣中纤维素的无定型区和结晶区表面，纤维素晶体类型未发生变化。

2.2 过氧甲酸预处理对甘蔗渣水解、发酵和水解液中纤维素酶分布的影响

2.2.1葡萄糖和木糖得率 1 g预处理后的甘蔗渣在酶用量 10 FPIU/g、 pH 值4.8、 50 ℃条件下水解72 h，其葡萄糖和木糖得率如图3所示。由图可知，HPP-SCB的葡萄糖和木糖得率分别为9.11%和5.25%，FAP-SCB的葡萄糖和木糖得率分别为7.06%和4.89%。由数据可知，两者的酶解效率极低，这是因为单独HPP或FAP预处理对木质素脱除甚少，对提高后续酶解效率没有明显的作用。甘蔗渣经过氧甲酸预处理后，葡萄糖得率和木糖得率均明显提高。PAP-SCB-1酶解72 h时的葡萄糖得率达到98.71%，比单独HPP或FAP预处理分别提高了89.60和91.65个百分点；木糖得率达到91.05%，比单独HPP或FAP预处理分别提高了85.80和86.16个百分点。由于过氧甲酸预处理脱除了甘蔗渣中的绝大部分木质素，使得预处理后的甘蔗渣比表面积增大， 即纤维素酶对预处理后的甘蔗渣的可及性增加，酶解效率显著增加。此外，从图中还可以看出，当过氧化氢和甲酸的比例为1 ∶4和1 ∶8时，酶解72 h时葡萄糖得率为 67.98%(PAP-SCB- 4)和44.33%(PAP-SCB-8)，葡萄糖得率随过氧甲酸中甲酸用量增加而降低，这可能是因为甲酸浓度增大，甘蔗渣表面木质素发生再次缩聚，导致木质素含量略微增加，进而在酶水解过程中产生非生产性吸附，影响后续酶解糖化得率[16]。

a.葡萄糖glucose； b.木糖xylose

2.2.2乙醇得率 利用酿酒酵母发酵，可将葡萄糖转化为乙醇，完成糖类到乙醇的生物转化。将预处理甘蔗渣酶水解72 h后的水解上清液接入酵母进行 24 h发酵，其乙醇质量浓度和乙醇得率如表2所示。由表可知， HPP-SCB酶解液发酵后，乙醇质量浓度和得率分别为2.95 g/L和76.20%； FAP-SCB酶解液发酵后，乙醇质量浓度和得率分别为2.81 g/L和75.15%。而经过氧甲酸预处理的甘蔗渣酶水解液发酵后，乙醇质量浓度和转化率明显提高。PAP-SCB-1发酵后乙醇质量浓度和乙醇得率分别为17.10 g/L和84.06%，表明过氧甲酸预处理可提高甘蔗渣酶解得率，使水解上清液中葡萄糖浓度增大，从而改善发酵效果。此外，从表中可以看出，过氧化氢和甲酸比例由1 ∶1增加到1 ∶4和1 ∶8 时，乙醇质量浓度有所下降,主要是因为随着过氧化氢含量的减少，葡萄糖酶解效率逐渐降低，且在发酵过程中可能产生了抑制乙醇发酵的物质如糠醛、羟甲基糠醛等，导致乙醇得率下降。

表2 不同浓度过氧甲酸预处理对甘蔗渣酶解液发酵的影响

2.2.3水解液中纤维素酶的分布 预处理甘蔗渣进行72 h酶水解，收集不同时间点的上清液，通过Bradford法测定上清液中蛋白质质量分数的变化，分析纤维素酶的分布情况，结果如图4所示。反应开始(2 h)时，大量的纤维素酶蛋白快速吸附到木质素上，导致上清液中蛋白质质量分数迅速下降，从图中可以看出，反应 6 h时，SCB水解体系中蛋白质质量分数为初始蛋白质量分数的36.30%。HPP-SCB和 FAP-SCB 水解上清液中的平均蛋白质量分数分别为初始蛋白质量分数的27.48%和27.96%，经过氧甲酸预处理后的甘蔗渣水解液中蛋白质质量分数进一步降低，其中PAP-SCB-1在6 h时水解上清液中的蛋白质质量分数下降至41.52%，表明经过氧甲酸预处理脱除了大量木质素后，甘蔗渣对酶的吸附能力增强。水解12 h时，PAP-SCB-1的水解液中酶蛋白质量分数达到了55.00%左右，较HPP-SCB和FAP-SCB分别提高了15.00%和11.00%，可能是因为在水解过程中，纤维素与纤维素酶之间属于可逆吸附，纤维素酶蛋白再次吸附到了PAP-SCB上，而HPP-SCB、FAP-SCB由于木质素脱除少，部分纤维素酶在木质素上发生无效吸附，导致酶解效率低[21]。

图4 预处理对甘蔗渣酶解过程中上清液蛋白质质量分数的影响Fig.4 Effect of pretreatmeat on protein content of supernatant during enzymatic hydrolysis of SCB

水解72 h 后，HPP-SCB和 FAP-SCB水解上清液中的酶蛋白质量分数分别为初始蛋白质量分数的27.54%和33.66%，与水解初期的蛋白质量分数相比变化不大，说明大量的纤维素酶可逆吸附于木质素上，没有参加纤维素水解反应，故HPP-SCB和 FAP-SCB酶水解72 h时，葡萄糖得率均小于10%。而PAP-SCB-1酶水解72 h时，上清液酶蛋白质量分数为55.02%，这主要是因为甘蔗渣经PAP预处理后，大部分木质素被脱除，木质素没有与纤维素竞争吸附酶蛋白，使更多的纤维素酶参与到甘蔗渣的水解过程。这使甘蔗渣在酶的作用下水解更充分。因此，PAP-SCB-1水解72 h后葡萄糖和木糖得率分别达到98.71% 和91.05%(图3)。这与微晶纤维素酶水解过程中的纤维素酶蛋白在底物木质素上呈现出的“吸附-催化-解吸附-再吸附”结论相一致[22]。

3 结 论

3.1对甘蔗渣先进行过氧甲酸预处理，然后加入纤维素酶进行水解，并将水解液用于发酵产乙醇。研究结果表明：过氧甲酸预处理有利于甘蔗渣中木质素的脱除，当过氧化氢和甲酸的体积比为1 ∶1时，预处理后的甘蔗渣PAP-SCB-1的木质素脱除率为84.30%。由于木质素脱除使得甘蔗渣无定型区部分溶解和孔隙率增加，因而PAP-SCB-1的结晶度和BET比表面积提高到54.18%和13.01 m2/g。

3.2在纤维素酶用量为10 FPIU/g(以预处理后的甘蔗渣质量计)时，PAP-SCB-1水解72 h时,其葡萄糖得率为98.71%，分别是HPP-SCB的10.84倍和FAP-SCB的13.98倍；水解12 h时，水解液中酶蛋白质量分数为55.00%，较相同条件下的HPP-SCB和FAP-SCB分别提高了15.00%和11.00%，这是因为甘蔗渣经PAP预处理后，大部分木质素被脱除，纤维素与纤维素酶发生可逆吸附，提高了酶解效率。

3.3过氧甲酸预处理有利于发酵糖类到生物乙醇的转化，PAP-SCB-1水解72 h后的水解液经24 h发酵可得到乙醇质量浓度和得率分别为17.10 g/L和84.06%，较 HPP-SCB(2.95 g/L 和76.20%)和FAP-SCB(2.81 g/L和75.15%)提升明显。