紫苏籽多糖对高脂饮食小鼠脂代谢和抗氧化作用的影响

刘敏，张岚，王丹，王长文，2*

（1.吉林医药学院公共卫生学院，吉林 吉林 132000；2.吉林医药学院慢病防治科研实验中心，吉林 吉林 132000）

世界卫生组织最新报告指出，全球超过13%的成年人患有肥胖症；到2030年，全球估计有30%的成年人肥胖[1]。肥胖不仅是形象问题，它已经被定义为一种慢性疾病，其会导致个体易患多种疾病，例如非酒精性脂肪性肝病、血脂异常、高血压等[2-4]。目前，通过生活方式干预和药物治疗是减肥的常见选择，但生活方式干预易受其他因素干扰而导致效果一般，而药物治疗则有不可避免的副作用。因此，近年来人们致力于开发更有效的抗肥胖生物活性物质。

紫苏籽是紫苏[Perilla frutescens（L.）Britt]的种子，紫苏和紫苏籽均被国家卫生部列入为药食同源名单中。研究表明，紫苏籽中含有黄酮、多肽、多酚等多种生物活性成分，具有降血脂、提高机体抗氧化能力和提高免疫力功能的作用[5]。近年来，植物多糖因降血糖、降血脂等作用已受到人们的广泛关注。研究发现，油茶籽粕多糖能够改善高血脂小鼠脂代谢紊乱和调节肠道菌群[6]。刘子坤等[7]研究表明，紫苏籽多糖可提高小鼠的免疫能力并抑制肿瘤细胞的生长。然而，关于紫苏籽多糖对高脂日粮饲喂引起小鼠的脂代谢异常和氧化应激的影响相关研究较少。因此，本研究以紫苏籽多糖为研究对象，探讨高脂饮食的小鼠日粮中补充紫苏籽多糖的降脂和抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫苏籽：亳州市康本堂药业有限公司；200只3周龄SPF级雄性昆明种健康小鼠（体质量10 g～12 g）：吉林省实验动物中心。紫苏籽多糖（Perilla frutescens seeds polysaccharide，PFSP）由长春大学食品科学与工程学院自制（紫苏籽粕中紫苏籽多糖得率为6.85%，纯度＞94%）。

目的基因上下游引物：生工生物工程（上海）有限公司；植物BCA蛋白试剂盒：上海酶联生物科技有限公司；RNA提取试剂盒、SYBR Green RT-PCR试剂盒：宝生物工程（大连）有限公司；生化指标、氧化还原指标等测定使用的试剂盒：南京建成生物工程研究所，测定过程按照相应试剂盒说明书进行操作。

1.2 仪器与设备

BLHH-6N数显电热恒温水浴锅：上海森信仪器有限公司；Uvmini-1240紫外可见分光光度计：日本岛津公司；TS-2脱色摇床：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；TGL-21高速冷冻离心机：长春市智能仪器设备有限公司；ABI Life7500荧光定量PCR仪：长春市一向科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试验设计与饲养管理

首先将SPF级雄性昆明种健康小鼠放置在温度为20℃～24℃和相对湿度为55%～65%饲养室内，循环光照12 h。经1周适应性饲养后，将150只小鼠随机分为对照组（control group，CK 组）、高脂日粮组（high-fat diet group，HF组）、低剂量紫苏籽多糖组（low-dose Perilla frutescens seeds polysaccharide group，L-PFSP 组）、中剂量紫苏籽多糖组（middle-dose Perilla frutescens polysaccharide group，M-PFSP组）和高剂量紫苏籽多糖组（high-dose Perilla frutescens seeds polysaccharide group，H-PFSP组）（n=30）。在 8周试验期间，CK 组饲喂普通日粮，而其他组饲喂高脂饮食。L-PFSP组、M-PFSP组和H-PFSP组分别口服紫苏籽多糖50、100 mg/（kg·d）和200 mg/（kg·d）。每周记录小鼠的体质量和采食量。

1.3.2 样品采集

在第8周时，各组小鼠处死前12 h禁食不禁水。各组小鼠按2.0 g/kg体质量注射氨基甲酸乙酯进行麻醉，眼眶静脉窦取血至抗凝管中，并测定小鼠空腹血糖；抗凝管中的血液样品（4℃，3 000 r/min，离心15 min），取血浆于-20℃保存。随后断颈处死小鼠，收集小鼠肝脏和肠道组织用于后续试验。本研究中的所有实验方案均经吉林医药学院实验动物福利伦理审查委员会批准。

1.3.3 指标测定

1.3.3.1 小鼠肝脏指数的测定

在处死小鼠之前对每只小鼠进行称重并记录体质量，处死小鼠后取出肝脏进行称重并计算肝脏指数。计算公式：肝脏指数=肝脏质量（g）/体质量（g）×100。

1.3.3.2 血清生化指标的测定

小鼠血清中总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL-C）、高密度脂蛋白 （high-density lipoprotein，HDL-C）、谷草转氨酶 （aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶 （alanine aminotransferase，ALT）和血糖（blood glucose，GLU）均使用试剂盒进行测定。

1.3.3.3 肝脏中TC和TG的测定

小鼠肝脏中TC和TG的水平使用试剂盒进行检测。取小鼠肝脏组织，按照试剂盒说明书将肝脏匀浆离心以获得上清液（3 500 r/min，15 min，4℃），随后按照试剂盒说明书操作步骤进行检测。

1.3.3.4 肝脏和肠道氧化还原指标的测定

小鼠肝脏和肠道中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化物酶（catalase，CAT）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平使用试剂盒进行测定，具体操作步骤按照相应的说明书进行。

1.3.3.5 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR）检测小鼠肝脏中脂代谢相关基因的表达

使用RNA提取试剂盒提取肝脏中总RNA并逆转录成cDNA。以β-actin为内参基因，设计和合成目的基因上下游引物。使用试剂盒进行相对基因表达量的测定。使用2-ΔΔCt方法计算目标基因mRNA的相对表达量。各基因引物序列如表1。

表1 引物信息Table 1 Primer Information

1.3.3.6 蛋白免疫印记（western blotting，Wb）检测小鼠肝脏中脂代谢相关蛋白的表达

将小鼠处死后立即收取肝脏组织，并切成等重的样品，放入含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。将肝脏组织裂解后，测定总蛋白浓度。然后，将蛋白质样品进行凝胶电泳并将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，将膜封闭，与一抗和二抗孵育，使用成像系统进行蛋白显影。利用Quality One软件进行蛋白灰度值测定分析，蛋白相对表达水平用“目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值”表示。

1.4 统计分析

所有实验数据以平均值±标准差表示，使用SPSS 20.0对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。并采用Duncan检验进行多重比较。使用GraphPad Prism 7.0制图。当P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 紫苏籽多糖对小鼠体重和采食量的影响

试验期间小鼠的体重的数据如图1所示。

图1 紫苏籽多糖对小鼠体重和采食量的影响Fig.1 Effects of Perilla frutescens seed polysaccharides on body weight and feed intake of mice

在试验结束时，CK组小鼠的平均体质量为（39.32±1.62）g，而HF组小鼠平均体质量为（49.70±1.71）g，HF组小鼠平均体质量明显高于CK组（P＜0.05）。L-PFSP组、M-PFSP组和H-PFSP组小鼠平均体质量分别为（46.47±1.57）g、（43.46 ±1.52）g和（42.94±1.33）g，紫苏籽多糖添加组小鼠平均体质量均明显低于HF组小鼠（P＜0.05）；并且 M-PFSP组和 H-PFSP组小鼠平均体质量显著低于L-PFSP组小鼠（P＜0.05）。采食量数据表明，试验小鼠的采食量为3.3 g～6.2 g。

2.2 紫苏籽多糖对小鼠肝脏指数和血清生化指标的影响

紫苏籽多糖对小鼠肝脏指数和血清生化指标的影响见表2。

表2 紫苏籽多糖对小鼠肝脏指数和血清生化指标的影响Table 2 Effects of Perilla frutescens seed polysaccharides on liver index and serum biochemical indexes in mice

由表2可知，与CK组相比，饲喂高脂日粮的小鼠肝脏指数以及血清中 TC、TG、LDL-C、ALT、AST 和GLU水平显著升高（P＜0.05），而HDL-C水平显著降低（P＜0.05）。与HF组相比，M-PFSP组和H-PFSP组小鼠肝脏指数以及血清中 TC、TG、LDL-C、ALT、AST 和GLU水平显著降低（P＜0.05），而HDL-C水平显著升高（P＜0.05）。而L-PFSP组小鼠的肝脏指数以及血清生化指标与HF组之间差异不显著（P＞0.05）。

2.3 紫苏籽多糖对小鼠肝脏中TC和TG水平的影响

紫苏籽多糖对小鼠肝脏中TC和TG水平的影响见图2。

图2 紫苏籽多糖对小鼠肝脏中TC和TG水平的影响Fig.2 The effect of Perilla frutescens seed polysaccharide on the levels of TC and TG in the liver of mice

由图2可知，与CK组相比，HF组小鼠肝脏中TC和TG水平显著升高（P＜0.05）。与HF组相比，H-PFSP组小鼠肝脏TC和TG水平显著降低（P＜0.05）；而L-PFSP组和M-PFSP组小鼠肝脏中TC和TG水平与HF组之间差异不显著（P＞0.05）。

2.4 紫苏籽多糖对小鼠肝脏和肠道抗氧化功能的影响

紫苏籽多糖对小鼠肝脏和肠道抗氧化功能的影响见表3。

表3 紫苏籽多糖对小鼠肝脏和肠道抗氧化功能的影响Table 3 The effect of Perilla frutescens seed polysaccharide on the antioxidant function of liver and intestine in mice

由表3可知，与CK组相比，HF饮食显著降低了小鼠肝脏和肠道中SOD、CAT和GSH-Px抗氧化酶的活性（P＜0.05），显著提高了MDA水平（P＜0.05）。与HF组相比，日粮中PFSP的添加（M-PFSP组和H-PFSP组）显著提高了小鼠肝脏和肠道中SOD、CAT和GSHPx的活性，显著降低了MDA水平（P＜0.05）。此外，与HF组相比，L-PFSP组小鼠肝脏中GSH-Px活性和肠道中SOD和GSH-Px活性显著升高（P＜0.05）。

2.5 紫苏籽多糖对小鼠肝脏中脂代谢相关基因mRNA表达的影响

紫苏籽多糖对小鼠肝脏中脂代谢相关基因mRNA表达的影响见图3。

图3 紫苏籽多糖对小鼠肝脏中脂代谢相关基因mRNA表达的影响Fig.3 The effect of Perilla frutescens seed polysaccharide on the mRNA expression of lipid metabolism-related genes in mouse liver

由图3可知，HF组小鼠肝脏中FAS mRNA表达水平显著升高，CPT-1和ATGL mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）。与HF组相比，紫苏籽多糖添加组（LPFSP组、M-PFSP组和H-PFSP组）小鼠肝脏中FAS mRNA表达水平显著降低，CPT-1和ATGL mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）。

2.6 紫苏籽多糖对小鼠肝脏中脂代谢相关蛋白表达的影响

紫苏籽多糖对小鼠肝脏中脂代谢相关蛋白表达的影响见图4。

图4 紫苏籽多糖对小鼠肝脏中脂代谢相关基因蛋白表达的影响Fig.4 The effect of Perilla frutescens seed polysaccharide on the expression of lipid metabolism-related genes and proteins in the liver of mice

由图4可知，与CK组相比，HF组小鼠肝脏中FAS蛋白表达量显著升高（P＜0.05），而CPT-1和 ATGL蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。与HF组相比，日粮中添加紫苏籽多糖（M-PFSP组和H-PFSP组）显著降低了小鼠肝脏中FAS蛋白表达水平（P＜0.05），显著提高了CPT-1和ATGL蛋白表达水平（P＜0.05）。与HF组相比，L-PFSP组小鼠肝脏中 FAS、CPT-1和ATGL蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

日粮脂肪摄入已被证明是机体脂肪沉积的重要因素，但同时高脂肪日粮可增加哺乳动物的氧化应激反应[8]。近年来，从天然产物中提取的生物活性化合物包括多糖、多酚、萜类化合物和生物碱已被证实可有改善高脂饮食导致的肥胖以及氧化应激的发生[9-10]。在本研究中，PFSP的补充显著改善了饲喂HF的小鼠的体重。此外，饮食中PFSP补充减少了胆固醇的合成，促进了血清中脂质的消除，并阻止了代谢异常的发展，这对降低HF饮食引起的高脂血症风险具有有益作用。

先前的研究表明，长期HF饮食会导致体重增加以及血清生化指标异常[11-12]，这与本研究结果一致。在本研究中，HF饲喂导致小鼠体重显著增加，血清中TC、TG和LDL-C显著升高，HDL-C显著降低。血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C指标常用于临床上高脂血症的诊断。但PFSP的补充显著降低了小鼠的体重和血清中TC、TG和LDL-C水平，提高了HDL-C水平。这提示PFSP可改善HF饮食导致的小鼠高脂血症。当前一些其他研究也证实了植物多糖可改善高脂血症[6，13-14]。孔瑕等[15]研究表明，在小鼠日粮中添加黄精多糖后，高脂血症小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平显著降低，且随黄精多糖含量的增加效果更好。空腹血糖是糖尿病检测的最常用指标，可反应胰岛β细胞的功能和基础胰岛素的分泌功能。通常，机体脂代谢异常往往伴随着糖代谢异常。在本研究中，HF饲喂小鼠空腹血糖显著升高，这与其他研究结果一致。日粮中补充PFSP后，HF饮食小鼠血糖显著降低，表明PFSP改善了小鼠糖代谢异常。研究表明，多糖主要从调节机体胰岛素敏感性、调节糖代谢过程中关键酶α-葡萄糖苷酶的活性和调节肠道菌群等途径改善肥胖导致的机体糖脂代谢异常[16]。此外，本研究的结果还表明PFSP的补充降低了HF饮食小鼠血清中ALT和AST水平以及肝脏中TC和TG水平。血清中ALT和AST水平的升高表明小鼠肝功能异常。而肝脏中TC和TG水平的升高表明HF饮食可能导致了小鼠出现脂肪肝。而PFSP的补充改善了因HF饮食导致的小鼠肝功能异常和脂肪肝的进一步发展。

已证明肥胖与体内氧化应激的增加密切相关，而高脂肪食物的摄入是导致肥胖的主要因素。据报道，体重的增加对细胞抗氧化能力具有负面作用[17]。Ojetola等[18]研究表明，高果糖高脂肪饮食显著降低了小鼠肝脏中GSH-Px和SOD活性。Miah等[4]研究也发现，HF饮食喂养的大鼠血浆和肝脏中氧化应激参数如MDA、NO 和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平显着升高。ROS的升高会导致体内细胞的细胞膜降解并产生脂质过氧化产物MDA，干扰蛋白质等生物分子的生物活性。此外，夏淑芳[19]研究发现，高脂日粮能够显著升高肾脏中ROS含量和肝脏中MDA含量，同时肾脏中SOD，CAT活性显著降低。在本研究中，HF饮食导致小鼠肝脏和肠道中抗氧化酶（SOD、CAT和GSH-Px）活性显著降低，MDA水平显著升高。然而，PFSP的补充显著降低了HF饮食小鼠肝脏和肠道中MDA水平，提高SOD、CAT和GSH-Px活性。这表明PFSP可通过提高小鼠机体的抗氧化酶活性来降低HF饮食导致的小鼠氧化应激。

本研究也探究了PFSP补充对HF饮食小鼠脂肪酸合成基因（FAS）和脂肪酸分解相关基因（CPT-1和ATGL）mRNA和蛋白表达的影响。FAS在动物体脂沉积中发挥重要作用，其是机体组织脂肪酸合成过程中的主要限速酶。而ATGL和CPT-1则在体内脂肪酸分解过程中扮演着重要角色[20]。ATGL能够将机体中的TG分解成游离脂肪酸，然后游离脂肪酸随血液循环供给动物所需要的能量。而CPT-1酶系统是长链脂肪酸进入线粒体供能所必须的。当动物禁食或长时间运动时，机体主要通过脂肪酸氧化供量，而长链脂肪酸作为一种主要的供能前体物质，不能通过简单扩散进入线粒体，必需要借助于CPT-1酶系统转入线粒体内[21]。在本研究中，HF饮食小鼠肝脏中FAS mRNA和蛋白表达水平显著升高，而CPT-1和ATGL mRNA和蛋白表达水平显著降低。这也初步从分子层面解释了HF饮食小鼠导致的体内脂代谢紊乱。然而，日粮补充PFSP后，HF饮食小鼠肝脏中FAS mRNA和蛋白表达水平显著降低，而CPT-1和ATGL mRNA和蛋白表达水平显著升高，小鼠体内脂代谢紊乱得到改善。

4 结论

本研究的结果表明，HF饮食会引起小鼠脂代谢和氧化应激，导致小鼠高脂血症和脂肪肝的发生。而PFSP能够改善小鼠脂代谢相关指标，提高肝脏中抗氧化酶的活性，并调节脂代谢相关基因的表达，改善HF饮食引起的小鼠氧化应激和脂肪肝的发生。