桑叶蛋白超声波辅助提取工艺优化及其氨基酸组分分析

杨雯雯，李轲，王婷婷，贾娟，刘心如

（1.河南工业大学漯河工学院，河南 漯河 462002；2.漯河职业技术学院，河南 漯河 462002；3.河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001）

桑叶（Folium mori），又名铁扇子、蚕叶，是桑科植物桑的干燥叶，是一种药食同源的多功能植物，桑叶中含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、多糖、生物碱等物质，具有极高的食用价值和药用价值[1-2]。桑叶性寒，味甘、苦，有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效，可用于降血压、降血脂、预防心肌梗塞、降血糖、护肝、消炎等[3-8]。桑叶中的蛋白质含量较高，为21%～27%，且氨基酸种类齐全，可作为植物蛋白食品的原料[9-10]。

目前，桑叶蛋白的提取多采用超声波辅助提取或者盐水浸提法。李刚凤等[2]通过正交试验法优化了超声波辅助提取桑叶蛋白的工艺；朱天明等[11]采用纤维素酶辅助提取桑叶蛋白。植物细胞中含有大量的营养物质，但细胞壁坚固且不利于营养成分的溶出，超声波独具的物理特性能促使植物细胞组织变形或破壁，使植物中的有效成分提取更充分，提取率比传统工艺显著提高，已广泛应用于天然产物的提取[12]。将超声波破碎和超声波辅助提取相结合，配合适宜的溶剂提取天然活性成分，具有快速、高效等优点。本文通过响应面法优化桑叶蛋白超声辅助波提取工艺，对其氨基酸组分进行分析，以期为桑叶蛋白的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑叶（澳桑1号）：漯河市义林农业发展有限公司，为高蛋白桑叶，霜后采摘，自然晾干后粉碎，过60目筛，于50℃烘干至恒重备用。

牛血清白蛋白：北京索莱宝生物科技有限公司；考马斯亮蓝 G-250、NaCl、乙醇（均为分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

L-8900全自动氨基酸分析仪：日本日立有限公司；BILOW-650Y超声波细胞粉碎机：上海比朗仪器有限公司；UV-2600型紫外可见分光光度计：龙尼柯（上海）仪器有限公司；FA2004型电子天平：上海上平仪器有限公司；TFW100高速万能粉碎机：北京市永光明医疗仪器有限公司；PHS-3C精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；恒温加热磁力搅拌器：杭州仪表电机有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑叶蛋白提取工艺

精确称取桑叶粉末3.0 g，置于250 mL锥形瓶中，以一定的液料比加入NaCl溶液，摇匀后在设定的超声波功率下进行破碎，在超声波清洗机中再次提取，于4 000 r/min离心10 min，取上清液测定蛋白含量，其它上清液于2℃～8℃冷藏备用[1]。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 液料比对桑叶蛋白提取率的影响

称取桑叶粉3.0 g，以0.4%NaCl溶液为浸提液，以液料比 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）添加浸提液，在超声波功率390 W下超声波破碎20 min，40℃超声波辅助浸提40 min，离心，测定桑叶蛋白提取率。

1.3.2.2 破碎时间对桑叶蛋白提取率的影响

称取桑叶粉3.0 g，以0.4%NaCl溶液为浸提液，液料比40∶1（mL/g），在超声波功率390 W下超声波破碎10、15、20、25、30 min，40 ℃下超声辅助浸提 40 min，离心，测定桑叶蛋白提取率。

1.3.2.3 破碎功率对桑叶蛋白提取率的影响

称取桑叶粉3.0 g，以0.4%NaCl溶液为浸提液，以液料比 40∶1（mL/g）添加浸提液，在功率 130、260、390、520 W下超声波破碎20 min，40℃下超声辅助浸提40 min，离心，测定桑叶蛋白提取率。

1.3.2.4 浸提时间对桑叶蛋白提取率的影响

称取桑叶粉3.0 g，以0.4%NaCl溶液为浸提液，以液料比40∶1（mL/g）添加浸提液，在超声波功率390 W下超声波破碎20 min，40℃下超声辅助浸提20、30、40、50、60 min，离心，测定桑叶蛋白提取率。

1.3.2.5 NaCl浓度对桑叶蛋白提取率的影响

称取桑叶粉3.0 g，以0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%NaCl溶液为浸提液，以液料比 40∶1（mL/g）添加浸提液，在超声波功率390 W下超声波破碎20 min，40℃下超声辅助浸提40 min，离心，测定桑叶蛋白提取率。

1.3.3 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计原理[13-14]，以蛋白提取率为响应值，对桑叶蛋白提取工艺进行四因素三水平的响应面分析方法试验设计，试验设计见表1。

表1 桑叶蛋白提取试验因素水平Table 1 Levels and factors of mulberry leaf protein extraction

1.3.4 桑叶蛋白提取率的测定

以牛血清白蛋白为标准品，采用考马斯亮蓝法测定浸提液中蛋白含量，试验所得标准曲线为Y=0.00522X+0.010 76，R2=0.999 3。取1 mL 1.3.1中上清液稀释定容后的溶液，与配制好的考马斯亮蓝溶液显色反应后，于595 nm处测定吸光值，计算桑叶蛋白的提取率[1]。

式中：C为桑叶蛋白测定液中蛋白浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；D为提取液的稀释倍数；M为桑叶粉质量，g。

1.3.5 桑叶蛋白氨基酸组分的测定

在最佳条件下，提取桑叶蛋白，离心得到的提取液，用2 mol/L的HCl调节pH值至4.0，4 000 r/min离心10 min，收集沉淀在40℃下烘干至恒重，得到桑叶粗蛋白。用GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》的方法对粗蛋白中氨基酸的组分进行测定。称取一定量桑叶蛋白样品放入水解管中，加入10 mL 6 mol/L盐酸溶液。真空封存，放在110℃恒温箱中水解22 h后，取出，冷却至室温。将水解液过滤后定容至50 mL容量瓶中，准确吸取1.0 mL滤液移入25 mL试管内，在40℃～50℃加热环境下减压干燥至干。用2.0 mL pH2.2柠檬酸钠缓冲溶液溶解，通过0.22 μm滤膜后，取20 μL溶液用氨基酸自动分析仪进行分析[9，15-16]（色谱条件：色谱柱是磺酸型阳离子树脂；检测波长是570 nm和440 nm）。

1.4 数据处理

试验所得数据利用Excel进行整理，所有试验均重复3次，试验数据以平均值±标准差表示，通过Origin 2018软件对试验数据进行绘图。运用Design-Expert V8.0.6软件进行响应面设计、方差分析和响应面作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对桑叶蛋白提取率的影响

液料比对桑叶蛋白提取率的影响见图1。

图1 液料比对桑叶蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on protein extraction rate from mulberry leaves

从图1可以看出，随着溶剂用量的增大桑叶蛋白的提取率先增加后降低，当液料比为40∶1（mL/g）时，桑叶蛋白提取率达到最大值，理论上溶剂用量越大，提取物质的得率越大，但当溶剂用量达到一定值后，溶剂中提取的蛋白与桑叶粉中的蛋白浓度相当，植物细胞组织内外的蛋白浓度差逐渐平衡，呈现一种溶出平衡趋势，提取率不再有明显的变化，此时蛋白己基本提取完全，继续增加溶剂量，不仅会造成单位提取液中蛋白浓度的降低，而且浪费溶剂和能源，也给后续的浓缩工作带来困难[1-2]。因此，综合提取效果和节约成本等方面考虑，选择液料比为40∶1（mL/g）。

2.1.2 破碎时间对桑叶蛋白提取率的影响

破碎时间对桑叶蛋白提取率的影响见图2。

图2 破碎时间对桑叶蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of crushing time on protein extraction rate of mulberry leaves

由图2可知，在超声波作用下，桑叶蛋白细胞破碎程度逐渐增大，蛋白质的溶出量逐渐增多，但超声波作用时间过长，会影响蛋白的活性[17-18]，提取时间超过20 min之后，其提取率没有明显的增加，因此选择破碎时间为20 min为最佳。

2.1.3 破碎功率对桑叶蛋白提取率的影响

破碎功率对桑叶蛋白提取率的影响见图3。

由图3可知，桑叶蛋白提取率随破碎功率的增加呈现出先增大后减小的趋势。在功率从130 W升高到260 W时，提取率缓慢增加，功率从260 W升高到390 W时，蛋白提取率明显升高。随后伴随提取功率继续增加，蛋白提取率降幅明显。这可能是因为随着超声功率的不断提升，理化作用变得更为剧烈，对细胞的破碎效果加强；当功率达到390 W时，细胞被理化因素充分破坏，得率最大；随着功率的继续提升，理化作用过于强烈，所产生的热效应及其他影响因素破坏了桑叶蛋白的构型，故蛋白提取率略呈下降趋势[2，13]。因而选择破碎功率为390 W为宜。

2.1.4 浸提时间对桑叶蛋白提取率的影响

浸提时间对桑叶蛋白提取率的影响见图3。

图4 浸提时间对桑叶蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on protein extraction rate of mulberry leaves

由图4可知，在一定的时间范围内，蛋白的溶出率随着浸提时间的延长而提高，适当延长超声波的作用时间，可以增加细胞内的蛋白溶出，当浸提时间达到40 min时，蛋白的溶出率趋于平衡，继续延长浸提时间，蛋白质提取率降低，这可能是由于超声时间太长，提取液温度不断升高，由于蛋白质的热稳定性较弱，可能导致部分蛋白发生变性，且细胞中其他物质溶出，影响了显色反应，从而导致得率下降[19]。综合考虑，选取浸提时间为40 min比较适宜。

2.1.5 NaCl浓度对桑叶蛋白提取率的影响

NaCl浓度对桑叶蛋白提取率的影响见图5。

图5 NaCl浓度对桑叶蛋白提取率的影响Fig.5 Effect of NaCl concentration on protein extraction rate of mulberry leaves

从图5可以看出，随着NaCl溶液浓度的增大，桑叶蛋白提取率呈现先增加后减小的趋势，当NaCl浓度为0.4%时，其提取率最高，随后提取率开始下降。随着NaCl浓度的升高，电荷数增加，水化层遭到破坏，导致蛋白质的溶解度不断增加，蛋白提取率提高；而高浓度的NaCl浓度可能使得蛋白提取过程发生盐析现象，导致桑叶蛋白提取率随着NaCl浓度的增高而降低[2，20]。因此桑叶蛋白提取的最佳NaCl浓度为0.4%。

2.2 响应面试验

2.2.1 试验结果与方差分析

响应面中心组合设计方案与结果见表2。

表2 响应面中心组合设计方案与结果Table 2 Center combination design scheme and results of response surface

对桑叶蛋白提取率的各因素进行多元回归，拟合得到桑叶蛋白提取率与液料比、破碎时间、浸提时间、NaCl浓度之间的二次回归方程：桑叶蛋白提取率/%=9.140 00+0.424 17A+0.013 333B-0.099 167C+0.145 00D+0.020 000AB+0.100 00AC+0.117 50AD+0.095 000BC-0.33500BD+0.54250CD-0.74125A2-0.83250B2-0.66375C2-0.872 50D2。

根据表2试验结果，以桑叶蛋白提取率为响应值，对桑叶蛋白提取工艺的模型进行回归分析结果见表3。

表3 桑叶蛋白提取工艺回归方程模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation model of mulberry leaf protein extraction process

由方差分析结果中的 P 值可知：A、C、D、BD、CD、A2、B2、C2和 D2对蛋白提取率影响极显著，AD 对桑叶中蛋白提取率影响显著。此模型F=92.47，P＜0.01，结果影响极显著，失拟项P=0.627 2＞0.05，结果不显著，表明模型对数据有较好的拟合作用，可以用该方程代替真实点对试验结果进行分析。相关系数R2=0.989 3，说明98.93%以上的变化可由自变量解释，仅有1.07%的变化不被解释。调整系数Radj2=0.978 6，说明该模型的拟合程度较好，可以准确地预测出提取桑叶蛋白的最佳工艺条件。以上各因素对蛋白提取的影响顺序为液料比＞NaCl浓度＞浸提时间＞破碎时间。

2.2.2 响应面交互作用的分析

根据回归模型绘制相应的响应面曲面图。各因素对响应值的影响不是简单的线性关系，两因素之间的交互作用对响应面值的影响程度和响应面的曲面陡峭程度呈正比，即交互作用对响应值影响越强，曲面越陡峭，反之越平缓[21-23]。结果见图6～图11。

图6 液料比和破碎时间交互作用的响应面和等高线图Fig.6 Response surface and contour plot of interactions between liquid-solid ratio and crushing time

图7 液料比和浸提时间交互作用的响应面和等高线图Fig.7 Response surface and contour plot of interactions between liquid-solid ratio and extraction time

图8 液料比和NaCl浓度交互作用的响应面和等高线图Fig.8 Response surface and contour plot of interactions between liquid-solid ratio and NaCl concentration

图9 破碎时间和浸提时间交互作用的响应面和等高线图Fig.9 Response surface and contour plot of interactions between crushing time and extraction time

图10 破碎时间和NaCl浓度交互作用的响应面和等高线图Fig.10 Response surface and contour plot of interactions between crushing time and NaCl concentration

图11 浸提时间和NaCl浓度交互作用的响应面和等高线图Fig.11 Response surface and contour plot of interactions between extraction time and NaCl concentration

由图6～图11可知，NaCl浓度和浸提时间的交互作用，破碎时间和NaCl浓度的交互作用，对蛋白提取率影响极显著，液料比和NaCl浓度的交互作用影响较显著，其他交互项不显著。

2.2.3 最佳工艺条件的验证

通过Box-Benhnken优化分析，得到超声波辅助提取桑叶蛋白的最佳工艺条件：液料比42.94∶1（mL/g），破碎时间19.95 min，浸提时间39.88 min，NaCl浓度0.42%，在此优化条件下，理论上得到的桑叶蛋白提取率为9.21%。在最佳的提取条件下，进行验证试验。根据实际条件，将最佳提取条件修正为液料比43∶1（mL/g），破碎时间20 min，浸提时间40 min，NaCl浓度0.42%，此条件下桑叶蛋白提取率为9.19%，理论值与实际值很接近，说明该试验的拟合性能较好，该模型具有很好的分析预测能力，分析得到的最佳提取工艺合理，具有一定的应用价值。

2.3 桑叶蛋白氨基酸组分的分析

用GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》的方法测定粗蛋白中氨基酸的组分。利用氨基酸组分测定仪对提取的桑叶粗蛋白中的17种氨基酸组分进行分析测定，分析测定结果见表4。

表4 桑叶粗蛋白氨基酸组分Table 4 Amino acid components in crude protein of mulberry leaves

如表4所示，桑叶粗蛋白中氨基酸种类齐全，检测出了17种氨基酸，其中包括除色氨酸以外的7种必需氨基酸，氨基酸总含量为77.38 g/100 g粗蛋白，其中必需氨基酸含量为29.11 g/100 g粗蛋白，占总氨基酸含量的 37.6%，必需氨基酸（essential amino acids，EAA）/非必需氨基酸 （non-essential amino acids，NEAA，NEAA）为0.603，略低于联合国粮农组织及世界卫生组织（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，FAO/WHO）标准规定的必需氨基酸含量40%和EAA/NEAA值0.614[9]。桑叶粗蛋白中含量最高的两种氨基酸为谷氨酸和天门冬氨酸，分别占氨基酸总量的13.3%和10.8%，这两种氨基酸是构成鲜味的主要成分，在医药、食品和化工等方面有着广泛的用途[17]。

4 结论

本文研究了桑叶蛋白的超声波辅助提取工艺，在单因素试验的基础上，设计响应面试验对提取工艺进行优化，通过高效液相色谱法对桑叶蛋白中的氨基酸组分进行测定。桑叶蛋白的最佳提取工艺为液料比43∶1（mL/g），破碎时间 20 min，浸提时间 40 min，NaCl浓度0.42%，在此条件下桑叶蛋白的提取率为9.19%。提取的桑叶粗蛋白中的氨基酸种类丰富，其中必需氨基酸含量为29.11 g/100 g粗蛋白，占总氨基酸含量的37.6%，必需氨基酸（EAA）/非必需氨基酸（NEAA）为0.603，接近于FAO/WHO标准规定的必需氨基酸含量40%和EAA/NEAA值0.614。因而桑叶蛋白的含量高，且氨基酸种类丰富，是一种十分优良的蛋白质资源，具有广阔的发展前景。