基于GC-MS的棉子糖肠球菌代谢组学样品前处理方法的优化

杨新达，牛肖凡，刘仲浩，张健，张巧珍，高强*

（1.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心，天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.天津科技大学理学院，天津 300457）

棉子糖肠球菌（Enterococcus raffinosus）属于革兰氏阳性肠球菌属（Enterococcus）的兼性厌氧菌，在自然界中分布较广[1-4]，并且广泛存在于哺乳动物的肠道及生殖道内，为肠道菌群的重要组成部分[5-6]。王春艳等[7]在新疆伊犁传统手工奶酪中分离出棉子糖肠球菌，旭日花[8]在通辽牧区乳制品中分离出棉子糖肠球菌菌株，进一步证实了棉子糖肠球菌在食品发酵领域的生物安全性。棉子糖肠球菌为野生大熊猫肠球菌的优势菌，大熊猫野化放归后，粪便中肠球菌的种类增加，均衡各类肠球菌所占比例，有利于放归大熊猫快速适应野外生存环境[9]。通过生物发酵法，棉子糖肠球菌可生产 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）。陈慧敏等[10]、段强等[11]使用在东北酸菜中分离出的棉子糖肠球菌进行γ-氨基丁酸的高产发酵，为工业化γ-氨基丁酸的发酵生产提供了新的思路。

随着仪器科学的发展进步，质谱类仪器的检测精度逐步提高、检测范围也逐步扩大，使得准确检测出小分子代谢物成为可能[12-13]。气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 技术凭借其发展较成熟、灵敏度与分辨率高以及标准谱图库丰富等特点，被广泛地应用到代谢组学研究中[14-16]。GCMS能准确地检测出大量的胞内小分子代谢物（相对分子质量小于1 500 Da）[17-18]，并通过与数据库匹配进而对被检测物质进行定性与定量[19-20]。目前，代谢组学在微生物相关研究领域被广泛应用，通过代谢组学研究各种微生物的方法常有报道，但是关于棉子糖肠球菌的代谢组学的相关研究较少。本试验旨在探究棉子糖肠球菌最优的代谢组学样品前处理方法，着重研究样品前处理过程中破碎方式（液氮研磨破碎和超声破碎）、清洗次数和冻融时间对代谢物提取的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

棉子糖肠球菌（Enterococcus raffinosus）：天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心从东北酸菜中分离筛选获得，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5584。

1.1.2 主要试剂

甲氧基胺盐酸盐-吡啶、N-甲基-N（三甲基硅烷）三氟乙酰胺、氘代琥珀酸(色谱纯)：北京西格玛生物技术有限公司；甲醇、乙醇、三氯甲烷(色谱纯)：赛默飞世尔科技有限公司；试验用水为超纯水。

1.1.3 仪器与设备

5977B-7890A型单四极杆气质联用系统：美国安捷伦科技（中国）有限公司；Milli-Q Advantage A10超纯水制备系统：美国Millipore公司。

1.1.4 主要培养基

斜面培养基：蛋白胨15 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖 10 g/L、乙酸钠 5 g/L、柠檬酸铵 2.5 g/L、硫酸锰0.05 g/L、硫酸镁0.2 g/L、琼脂15 g/L。

发酵培养液：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖10 g/L、乙酸钠0.1g/L、柠檬酸铵2.5g/L、硫酸锰0.05g/L、硫酸镁0.2 g/L、吐温-80 1 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌体制备

将冻存于-80℃甘油管中的棉子糖肠球菌CGMCC No.5584菌株接种于斜面培养基，30℃培养12 h，使用无菌接种环挑取单一菌落接种于发酵培养液中，30℃静置培养24 h，从而得到菌液样品，为保证试验的准确性，每个样品选取5个平行。

1.2.2 菌体淬灭

将甲醇和超纯水按照体积比3∶1混合得到淬灭液，取150 mL预冷至-20℃以下的淬灭液与50 mL菌液，快速混合淬灭5 min，8 000 r/min、4℃离心10 min，将菌体沉淀转移至50 mL离心管中，4℃保存备用。

1.2.3 菌体处理

1.2.3.1 清洗

将淬灭好的菌体加入4℃预冷的清洗液（质量分数0.6%的NaCl溶液）混匀，8 000 r/min、4℃离心 10 min，弃上清液，分别重复2、3、4次；离心后得到菌体沉淀，于-80℃保存备用。

1.2.3.2 破碎

液氮研磨法：取清洗3次后的菌体，将菌体置于洁净的16层医用纱布滤去水分，再将处理后的菌体置于液氮预冷的研钵中，研磨至细粉状，称取100 mg菌体粉末至液氮预冷的2 mL离心管中，置于冰上保存；每管样品加入1 mL提取液，涡旋3 min混匀至乳白色，置于冰上保存。

超声破碎法：取清洗3次后的菌体与4℃预冷的甲醇混匀，置于40 kHz的超声仪中破碎，放入冰袋保持低温环境，超声30 min，每隔5 min将菌体摇匀1次，真空冷冻干燥后，保存于-80℃备用。

1.2.3.3 冻融

将液氮研磨破碎处理后的样品置于液氮中冻融，冻融时间分别为 2、3、4 min，重复 4 次，0.22 μm 微孔滤膜过滤至1.5 mL离心管中，封口，于-80℃保存。

1.2.4 胞内小分子代谢物提取

在装有样品的1.5 mL离心管中加入1 mL提取液，涡旋3 min混匀至乳白色，置于冰盒上保存。

1.2.5 衍生化反应

（1）取 200 μL 样品提取液加入 20 μL 的 1 mg/mL氘代琥珀酸，真空冷冻干燥之后，加80 μL甲氧基铵盐酸盐-吡啶溶液，将样品充分溶解，40°C水浴80 min。

（2）水浴后的样品中加入120 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺，混合均匀后，置于40℃水浴锅中水浴衍生80 min。

（3）衍生后的样品于10000r/min、4℃离心5min后，取上清液100 μL加入已编号的进样瓶中，室温静置2 h后置于-80℃保存，用于后续的GC-MS检测[21]。

1.2.6 GC-MS检测条件

色谱条件：色谱柱为Agilent HP-5（60mm×0.25mm×0.25 μm）；载气为氮气；进样口温度为280℃；进样量为1 μL；流速为 1 mL/min；分流比为 5∶1；采用程序升温，初始温度70℃保持2 min，以5℃/min程序升温至290℃并保持5min。

质谱条件：接口温度为280℃；电离方式为电子轰击电离；离子源温度为230℃；扫描质量范围m/z 50～800[22]。

1.3 数据处理

将由GC-MS采集的原始数据和NIST 17.0数据库进行比对，对搜索得到的相应代谢物去除冗杂峰和重峰，然后将峰面积进行标准化、归一化处理，对相应物质进行匹配，用于后续分析。

2 结果与分析

2.1 不同破碎方法处理棉子糖肠球菌的主要代谢物成分比较

本试验通过采用超声和液氮冻融两种方式对菌体进行破碎，然后经代谢组学方法对不同处理方式的菌体进行胞内代谢物检测及分析，探究不同破碎方式对棉子糖肠球菌代谢组学样品前处理的影响。结果见图1和表1。不同处理获得的小分子代谢物差异的韦恩图见图2。

图1 不同破碎方式处理的小分子代谢物色谱图Fig.1 Chromatograms of small molecular metabolites released from the cells pretreated by different crushing methods

表1 不同处理获得的小分子代谢物差异情况Table 1 Differences of small molecular metabolites released from the cells pretreated by different methods

续表1 不同处理获得的小分子代谢物差异情况Continue table 1 Differences of small molecular metabolites released from the cells pretreated by different methods

图2 不同处理获得的小分子代谢物差异的韦恩图Fig.2 Venn diagrams of small molecular metabolites released from the cells pretreated by different methods

如图1和表1所示，液氮研磨法可检测出253种小分子代谢物，在NIST 17.0数据库中准确匹配到8类共47种物质，其中酯类5种、烯烃类1种、烷烃类2种、醇类5种、酸类30种、糖类1种、苯环类2种、其他（3-羟基吡啶，普遍认为是衍生剂吡啶的菌体羟化物）1种；超声破碎法却只能检测出211种小分子代谢物，而且仅准确匹配到7类共39种物质，其中酯类4种、烯烃类1种、烷烃类2种、醇类4种、酸类26种、糖类1种、苯环类1种。图2a表明，液氮研磨法准确匹配的47种物质完全覆盖了超声破碎法准确匹配的39种物质。因此，后续的试验均采用液氮研磨法对棉子糖肠球菌进行菌体破碎。

2.2 不同清洗次数处理棉子糖肠球菌的主要代谢物成分比较

清洗次数对棉子糖肠球菌代谢组学样品前处理的影响结果见图3。

图3 不同清洗次数提取小分子代谢物的色谱图Fig.3 Chromatograms of small molecular metabolites released from the cells washed for different times

如图3和表1所示，清洗2次可以检测出238种小分子代谢物，包括准确匹配出的7类43种物质，其中酯类4种、烯烃类1种、烷烃类2种、醇类4种、酸类28种、糖类1种、苯环类2种；清洗3次可以检测出253种小分子代谢物，包括准确匹配出的8类47种物质，其中酯类5种、烯烃类1种、烷烃类2种、醇类5种、酸类30种、糖类1种、苯环类2种、其他1种；清洗4次可以检测出197种小分子代谢物，包括准确匹配出的7类36种物质，其中酯类4种、烯烃类1种、烷烃类2种、醇类4种、酸类24种、糖类1种、苯环类2种。图2b表明，3次清洗得到的准确匹配的8类47种小分子代谢物完全覆盖2次和4次清洗准确匹配的7类43种和36种小分子代谢物。因此，后续的试验均对棉子糖肠球菌进行3次菌体清洗。

2.3 不同冻融时间处理棉子糖肠球菌的主要代谢物成分的比较

冻融时间对棉子糖肠球菌代谢组学样品前处理的影响结果见图4。

图4 不同冻融时间提取小分子代谢物的色谱图Fig.4 Chromatograms of small molecular metabolites released from the cells frozen-thawn for different time periods

如图4和表1所示，冻融2 min后可以检测出229种小分子代谢物，包括精确匹配出的7类41种物质，其中酯类5种、烷烃类1种、醇类4种、酸类27种、糖类1种、苯环类2种、其他1种；冻融3 min可以检测出253种小分子代谢物，包括精确匹配出的8类47种物质，其中酯类5种、烯烃类1种、烷烃类2种、醇类5种、酸类30种、糖类1种、苯环类2种、其他1种；冻融4 min可以检测出197种小分子代谢物，包括精确匹配出的8类45种物质，其中酯类4种、烯烃类1种、烷烃类2种、醇类5种、酸类29种、糖类1种、苯环类2种、其他1种。图2c表明，冻融3 min得到的准确匹配的47种小分子代谢物完全覆盖了冻融2 min和4min准确匹配的41种和45种小分子代谢物。因此，后续试验对棉子糖肠球菌的冻融时间控制为3 min。

棉子糖肠球菌胞内小分子代谢物成分的总离子流图见图5所示。

图5 棉子糖肠球菌胞内小分子代谢物成分的GC-MS总离子流图Fig.5 Total ion chromatogram of small molecular metabolites of Enterococcus raffinosus

由图5可知，经优化后的前处理方法处理的样品，通过GC-MS检测共鉴定出253种胞内小分子代谢物，经NIST17.0数据库比对，共匹配出8类47种物质，结合表1可知，其中酯类5种、烯烃类1种、烷烃类2种、醇类5种、酸类30种、糖类1种、苯环类2种、其他1种。

3 讨论与结论

在GC-MS检测过程中，不同的前处理方式对提取的小分子代谢物种类贡献不同[23-25]。

本试验首先比较了液氮研磨法和超声破碎法对菌体的破碎效果。结果表明，液氮研磨法共提取出253种小分子代谢物，超声破碎法则只能提取出211种小分子代谢物。其中可以精确匹配的8类小分子代谢物中，超声破碎较液氮研磨法有不同程度的减少，其中酯类、醇类、苯环类和其他类分别减少了1种，而差异性最明显的酸类减少了4种，说明液氮研磨法更有利于小分子代谢物的提取，尤其是酸类物质。

不同的清洗次数对小分子代谢物的提取具有较明显的影响。清洗次数为2次时，检测出238种小分子代谢物；清洗3次时，检测出253种小分子代谢物，其中精确匹配的小分子代谢物的类别和数量最多，为8类47种；清洗4次时，检测出197种小分子代谢物。在一定范围内，增加清洗次数有利于小分子代谢物的提取，清洗次数过多则会导致胞内小分子代谢物泄露，进而影响后续试验的精度。所以，清洗3次为最佳清洗次数。

不同的冻融时间也对小分子代谢物的提取有一定的影响。冻融时间为2 min时，检测出229种小分子代谢物；冻融时间为3 min时，检测出253种小分子代谢物，其中精确匹配的小分子代谢物的类别和数量也最多，为8类47种；冻融时间为4min时，检测出247种小分子代谢物。在一定范围内，增加冻融时间有利于小分子代谢物的提取，但冻融时间过长对小分子代谢物的提取影响不大，所以，3 min冻融时间为最佳冻融时间。

综上所述，基于本试验结果，选取液氮研磨破碎、冻融3 min、清洗3次对棉子糖肠球菌菌体样本进行前处理，能最多检测到253种小分子代谢物，并最大限度地精确匹配出其中的8类47种，更有利于后续代谢组学试验的进行。

本研究利用GC-MS技术，通过探究不同菌体破碎方式、清洗次数和冻融时间对棉子糖肠球菌胞内代谢物提取的影响，发现适当的改变前处理方法的部分参数，可有效地增加胞内代谢物提取数量和种类，对于液氮研磨破碎、清洗3次、冻融3 min优化处理的样品，共检测出253种胞内小分子物质，使用NIST 17.0数据库可精确匹配出47种物质，其中酯类5种、烯烃类1种、烷烃类2种、醇类5种、酸类30种、糖类1种、苯环类2种、其他1种。本研究为棉子糖肠球菌代谢组学样品前处理研究提供了一定的参考依据。