AZD9291 通过抑制PI3K-AKT-mTOR 通路抑制鼻咽癌细胞的增殖和迁移

鼻咽癌是一种发病原因不明的上皮恶性肿瘤，是我国耳鼻咽喉恶性肿瘤的主要致死因素。中国人群的鼻咽癌死亡率（0.012‰）显著高于世界平均水平（0.007‰），位居全球鼻咽癌死亡率的第23位。目前临床仍以放疗作为鼻咽癌早期治疗的有效手段。不可否认的是放疗在鼻咽癌前期治疗中占据主导地位，然而放疗后局部复发和远处转移是目前常见的治疗失败的主要原因，即使尽可能的提高治疗精度和化疗密集度，但是对于晚期病人仍未取得良好的疗效。联合治疗成为了治疗局部晚期疾病的重要手段，同时许多实验也表明晚期鼻咽癌联合治疗比单纯放疗或化疗的生存率更高。近年来，靶向药物治疗鼻咽癌显示出了非同寻常的效果，它有着相对于放化疗副作用小的优点，已成为治疗鼻咽癌的研究热点。因此寻找有效的靶向药物是亟待解决的问题。

表皮生长因子受体(EGFR)属于糖蛋白，在调节细胞生理功能方面具有重要作用，相关研究已证实鼻咽癌、肺癌、结直肠癌以及乳腺癌的转移、增殖与EGFR的表达密切相关，AZD9291是一种高效选择性EGFR突变体抑制剂，主要用于存在EGFR T790M突变阳性的局部晚期或转移性非小细胞肺癌，临床显示出良好的抗肿瘤活性；亦有研究表明，AZD9291通过诱导细胞凋亡而表现出强大的抗结直肠癌效果。由于EGFR在鼻咽癌患者中高表达，因此我们期待拓展其在其他肿瘤中的应用。然而，AZD9291对鼻咽癌细胞体外生长的影响、是否能够抑制细胞转移以及具体的抗肿瘤机制尚无文献报道。本研究以三代EGFR-TKI AZD9291 为研究对象，观察其对鼻咽癌HNE1 和CNE2Z细胞的增殖抑制作用以及对细胞迁移能力的影响，并探讨相关可能机制，为开辟鼻咽癌的临床治疗途径提供新的理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人鼻咽癌HNE1 和CNE2Z 细胞（普诺赛），RPMI 1640细胞培养液（赛默飞），PBS（塞维尔），胎牛血清（四季青），胰酶（Biosharp），PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Vimentin 抗体（CST），Ecadherin 抗体（Proteintech），EGFR、p-EGFR 抗体(Abcam)，CCK8、Transwell小室、青霉素-链霉素、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自合肥志宏泰克生物技术有限公司，MHY-1485、AZD9291（MCE）。

我国社会主义建设面临着纷繁复杂的局势，创新创业离不开对基本国情、国家政策、经济社会转型、国内外形势的理解。只有充分理解政治、经济发展的趋势，才能找准创新创业的切入点，保证创业朝着正确方向前进。在创新创业教育中融入批判性思维，有助于提高大学生的政治素养和明辨是非的能力，培养时事敏感度，让他们有能力参与到经济、政治生活中来。培养大学生的批判性思维，有助于提高他们独立的思考能力、思辨能力、解决问题的能力，提高他们理解和消化国家政策的能力，使他们能主动进行信息的识别、选择与理解，最后做出合理、有依据的判断，从而保证创业的可持续发展。

1.2 细胞培养

HNE1 和CNE2Z 细胞使用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基培养，置于37 ℃、5%CO饱和湿度的细胞培养箱中培养。

CCK8 结果显示，HNE1 细胞在0、0.5、1、2、4、8 μmol/L 的AZD9291 作用下增殖受到明显抑制；CNE2Z细胞在0、1、2、4、8、16 μmol/L的AZD9291作用下增殖受到明显抑制。随着药物处理时间的增加抑制作用增加（图1A）。分别使用较低浓度AZD9291（0、0.5、1、2 μmol/L）处理HNE1和CNE2Z细胞，观察集落克隆形成。结果显示HNE1 和CNE2Z 细胞在AZD9291的作用下增殖受到明显抑制，随着给药浓度的增加抑制作用增加（图1B）。

1.3 CCK8实验

将HNE1和CNE2Z细胞以5×10/孔种植于96孔板，24 h后分别更换为含药培养基，HNE1细胞加入含有浓度分别为0、0.5、1、2、4、8 μmol/L的AZD9291的新鲜培养液，CNE2Z细胞加入含有浓度分别为0、1、2、4、8、16 μmol/L 的AZD9291 的新鲜培养液。分别在给药24、48、72 h后吸出培养基，加入含有CCK8试剂的新鲜培养基（按照1 mL 培养基100 μL CCK8 的比例混匀），放入37 ℃培养箱中孵育1 h后，使用酶标仪检测值。

1.4 细胞划痕实验

使用STLINK 作为仿真器，当LDC1000 检测到存在金属或硬币时，它会比较检测到的数据。然后，在软件中设置改变阈值以区分和识别导线和硬币的阈值，并且设置硬币阈值是700。

1.5 集落克隆实验

将处于对数生长期的HNE1和CNE2Z细胞以1×10/孔种植于6孔板中，分别加入含有0、0.5、1、2 μmol/L AZD9291的新鲜培养液，培养到14 d或绝大多数单克隆细胞数大于50为止，用PBS冲洗后用4%多聚甲醛进行固定30 min，后用PBS冲洗，再加入结晶紫进行染色20 min，用PBS冲洗数次，晾干。

1.6 迁移实验

随着给药浓度的增加E-cadherin的表达明显的增加。Vimentin蛋白表达随着药物浓度的增加而降低。（图5）。

1.7 Western blot法检测蛋白表达水平

Western blot 结果显示，AZD9291 对HNE1 和CNE2Z细胞的EGFR、PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化均有抑制作用并随着给药浓度的升高抑制作用不断增强（图2）。

1.8 统计学处理

采用SPSS21.0软件对实验结果进行分析，数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析评价实验组间的差异，＜0.05为差异具有统计学意义。

将HNE1和CNE2Z细胞以5×10/孔种植于6孔板中，放置于37 ℃、5%CO饱和湿度的细胞培养箱中培养,待细胞长满后，用200 μL的移液器吸头垂直均匀划线，用PBS冲洗3次，分别加入含有0、0.5、1、2 μmol/L AZD9291的无血清培养液，分别在0 h和24 h用光学显微镜进行拍照，后使用ImageJ进行计算分析。

2 结果

2.1 AZD9291对HNE1和CNE2Z细胞的增殖抑制作用

目前，绝大多数员工所使用的手机都是智能手机，完全能够满足员工所需的各种E-training 形式，包括文字、视频、动画、联网、信息下载以及互动等各种功能。但由于通过手机开展E-training 是一个新生事物，不但作为发起方的企业处于探索阶段，而且作为接受方的员工也需要认知和适应过程，因此，实施手机E-training，应本着先易后难、循序渐进的原则，逐步探索适于本组织的最佳培训模式。

2.2 AZD9291对EGFR信号通路的影响

将细胞以一定密度种植于100 mm培养皿中，待细胞贴壁后，分别更换为含有0、2、4、8 μmol/L AZD9291的新鲜培养液，24 h后收集细胞并用RIPA裂解液，冰上裂解30 min，放入-20 ℃冷藏过夜，后置于12 000 r/min，4 ℃，离心30 min，取上清液，用BCA蛋白定量试剂盒定量后，调齐蛋白浓度。采用SDS-PAGE凝胶电泳法，电压为80 V至各孔穿过上层胶后，调整电压为120 V，直至蛋白跑至底部，后以200 mA 恒流转移至PVDF 膜上。转膜结束后，使用快速封闭液封闭30 min，用TPBS洗膜3次，放置一抗中4 ℃孵育过夜，TPBS洗膜3次，放入二抗中室温下孵育2 h，用TPBS洗膜3次，配置ECL显影液，浸润PVDF膜，凝胶成像系统进行显色拍照。

与对照组相比，随着给药浓度的增加，HNE1 和CNE2Z划痕愈合能力明显下降（图3），Transwell小室迁移实验结果显示给药后明显降低了细胞的迁移数量（图4）。

2.3 AZD9291对HNE1和CNE2Z细胞迁移能力的影响

3.网络多媒体+古诗词：通过适当运用多媒体，增加古诗词教学的新路径。利用网络免费优质资源，编写校本诗词教材，通过班级QQ群、微信群等网络平台，推送古诗词欣赏，专家专题讲座等内容，提高农村学生语言文字的接触量，引导学生扩大阅读。

2.4 AZD9291对HNE1和CNE2Z细胞迁移相关蛋白的影响

消化离心后收集HNE1和CNE2Z细胞，用无血清培养基重悬混匀后计数。向每个小室中加入含有2×10细胞的无血清细胞悬液100 μL，Transwell 下室加入600 μL含血清培养基，放入37 ℃、5%CO饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h后，取出小室，用PBS清洗，放入4%多聚甲醛中固定15 min，擦去小室内的细胞，用结晶紫染色15 min，用PBS清洗后自然晾干，置于光学显微镜下观察。

2.5 激活mTOR对AZD9291抑制HNE1和CNE2Z细胞迁移的影响

使用AZD9291 和mTOR 激活剂MHY-1485（10 μmol/L）作用于HNE1和CNE2Z细胞后，MHY-1485对细胞的迁移能力无明显影响，但可以部分逆转AZD9291对细胞的迁移能力抑制作用（图6）。

3 讨论

临床治疗鼻咽癌的方式主要为放疗和化疗。近几年，尽管治疗方案有较多进展，但是局部复发或远处转移常常导致治疗失败，这也使得鼻咽癌的晚期治疗效果不佳。相关研究已证实鼻咽癌患者接受靶向治疗可引起持久性的临床反应，有望成为个体化治疗的重要组成部分。

高效课堂是对传统课堂的优化与改进，它以学生为中心，以快乐为根本，在初中数学的教学过程中应用广泛。本文结合多年教学经历与实践，得出教师应该在提高学习兴趣与学习习惯，教学内容与活动，课后的探究性学习三个方面来提高课堂的有效性，不仅可以实现教师少教、学生多学的高效课堂模式，帮助学生从低效学习到高效学习再到终身学习的转变，还能促进学生创新思维、合作探究等各方面品质的形成，实现师生互动、生生互动的双向交流过程。教师在以后的初中数学过程中，还应不断探索高效课堂的教学模式，找到适合教学的最佳方案，进一步深化传统课堂改革，促进学生综合素质的提升。

肿瘤细胞的转移播散是肿瘤发生发展中最具危险的过程。有效减少肿瘤细胞从原发灶转移以及降低其本身的侵袭性是治疗晚期癌症的关键因素。上皮间质转化（EMT）是一个由充分分化的上皮细胞转化为间充质表型的过程，是导致肿瘤细胞侵袭和转移的关键。临床研究证明EMT 在鼻咽癌的侵袭、转移过程中扮演重要的角色，是鼻咽癌不良预后的重要表征，随着鼻咽癌恶性程度的增高，鼻咽癌细胞中上皮细胞标志物E-cadherin 蛋白表达水平降低，间质细胞标志物Vimentin蛋白等表达增加。蛋白质印迹法结果显示：随着AZD9291 剂量的升高，HNE1 和CNE2Z 细胞E-cadherin 蛋白上调，Vimentin蛋白下调。Transwell和划痕实验结果表明AZD9291 可以抑制HNE1 和CNE2Z细胞的迁移能力。

PI3K-AKT-mTOR通路做为EGFR的重要的下游信号通路之一，在细胞增殖、凋亡和代谢的过程中，起着重要的作用，在肿瘤细胞发生、侵袭和转移中也同样具有重要的作用。EGFR的酪氨酸磷酸化充当PI3K的停靠位点，然后刺激了磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸的生成并促进AKT的激活，通过激活PI3K-AKT-mTOR通路从而促进相关蛋白质的表达，进而促进细胞的增殖、侵袭和转移。本实验研究发现AZD9291 对HNE1和CNE2Z细胞的PI3K-AKT-mTOR信号通路有显著影响，能够显著降低PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化水平，随着给药浓度增加，PI3K-AKT-mTOR信号通路磷酸化水平降低，从而抑制鼻咽癌细胞增殖和迁移的作用。为进一步了解AZD9291抑制HNE1和CNE2Z细胞迁移的分子机制，接着我们开始验证，PI3K-AKTmTOR通路与鼻咽癌细胞迁移的关系，我们发现给予AZD9291 和激活剂的细胞的迁移能力较仅给予AZD9291的细胞有所增强，以此证明了我们的猜测，PI3K-AKT-mTOR信号通路与HNE1和CNE2Z细胞的增殖和迁移有关。

综上所述，本研究初步证实AZD9291能够抑制鼻咽癌HNE1和CNE2Z细胞的增殖和迁移行为，其机制可能与抑制EGFR下游PI3K-AKT-mTOR信号从而发挥对下游E-cadherin和Vimentin蛋白的调控有关，为鼻咽癌的治疗提供了新的思路及线索，为AZD9291用于鼻咽癌靶向治疗提供了一种新的可能。