东北林蛙源致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定及药敏试验

孟 欣 ， 孙大庆 ， 康元环 ， 张冬星 ， 单晓枫 ， 钱爱东

(吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林 长春 130118)

东北林蛙(Ranadybowskii) 是蛙科、林蛙属无尾两栖动物，主要分布于我国东北地区和内蒙古东北部，其具有极高的经济价值和科研价值，是我国重要的野生药用动物[1]。由于大量的人为捕杀、自然生态的破坏、外来物种的侵入等外界因素影响[2]，导致野生东北林蛙的数量骤减，其已经被列入《世界濒危动物红皮书》二级保护动物，为易危(V)物种[3]。

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)隶属于气单胞菌科(Aeromonadaceae)、气单胞菌属，广泛存在于淡水、污水和土壤中[4]，可诱发恒温动物、变温动物的全身性疾病，是一种典型的人—畜—鱼共患的致病菌[5-6]。因其可在多种水体以及水产动物体内寄生，可引起蛙类致病甚至死亡，给蛙类人工养殖业和野生蛙类的生存均造成了严重的威胁，引起了众多国内外学者的高度重视[7-8]。嗜水气单胞菌能够引起以蛙红腿和皮肤溃烂坏死为特征的细菌性传染病，常可引起急性出血性败血症等，病程短，传播能力强，近年来此类病例正在以惊人的速度增多，造成了极高的死亡率[9-11]。本试验对从吉林市某林蛙养殖场患病的东北林蛙脏器中分离纯化出的病原菌进行培养与鉴定，并对其致病性和耐药性进行检测，以期为东北林蛙的疾病防控与嗜水气单胞菌的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物 患病林蛙和健康林蛙，均购自吉林市某林蛙养殖场；斑马鱼，购自长春某花鸟鱼市场。

1.2 主要试剂 细菌基因组提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；细菌微量生化反应管(杭州天和生物试剂有限公司)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(长春飞凯生物有限公司)；药敏纸片(杭州滨河微生物试剂有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分离培养 观察病蛙体表以及大腿根部等出现病灶的部位，无菌操作取其病料在LB培养基中进行病原菌分离培养；同时对病蛙麻醉后在无菌条件下进行剖检，采集病蛙的肝脏、肾脏、脾脏和心脏，充分研磨制成混悬液，接种于LB培养基，于28 ℃恒温条件下培养18 h。挑取不同颜色、形态、大小的优势单菌落进行纯培养。培养物于4 ℃保存备用。

1.3.2 细菌溶血活性检测 将LB平板中的优势菌群进行纯化后，接种至哥伦比亚羊血琼脂平板上，37 ℃培养12 h，观察溶血圈，用毫米尺测量溶血圈的直径，评价各优势菌群的溶血活性。

1.3.3 动物回归试验 选择具有溶血活性的菌株用PBS稀释至相同浓度1×108CFU/mL，选择健康林蛙作为试验动物，腹腔注射稀释菌液(100 μL/只)，连续观察7 d，记录死亡情况，对菌株致病性进行检测。

1.3.4 斑马鱼半数致死浓度(LD50)测定 将分离的溶血活性及致病性兼有的菌株接种于LB培养基中恒温培养24 h，用PBS进行稀释，稀释浓度依次为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、10 CFU/mL和1 CFU/mL。选择斑马鱼作为实验动物，按照菌液稀释梯度数将健康斑马鱼分为7个浓度组，每组10尾，以0.2 mL/尾的剂量对斑马鱼进行腹腔注射。每天观察各组鱼的发病情况和死亡情况，并进行记录，计算菌株的LD50。

1.3.5 生理生化鉴定 将分离到的病原菌纯培养物分别接种至生化反应管内，30 ℃温箱中孵育12～24 h。根据说明书进行结果对比，进行生理生化鉴定。

1.3.6 分子生物学鉴定 取对数生长期的菌液，离心收集菌体，按照细菌基因组提取试剂盒说明书操作，提取细菌的总DNA。利用PCR对菌株的16S rDNA基因与gyrB管家基因进行扩增，引物序列见表1。将PCR产物进行电泳检测，出现预期目的条带后，按照试剂盒说明书进行胶回收，纯化后送至长春库美生物测序公司进行测序。将分离菌株的16S rDNA基因序列和gyrB基因序列经NCBI中的BLSAT检测系统进行序列同源性分析后，选取对比匹配度较高的几组基因，利用MEGA 6.0构建系统发育树。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.3.7 毒力基因检测 以分离菌株DNA为模板，采用PCR方法对气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、黏附素(Aha)、核酸酶(exu)、丝氨酸蛋白酶(ser)、脂肪酶(Lip)、密度感应系统调控基因(LuxS)这7种毒力基因进行检测，引物信息见表1。

1.3.8 药敏试验 采用改良K-B纸片扩散法，取20 μL纯化后的分离菌株，用接种环在培养基中均匀涂布，将制备好的药敏片分别按标记好的位置紧贴在培养基的表面。将培养皿放置于30 ℃恒温箱中培养8～12 h后，观察其抑菌圈的直径(mm)，以抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准，判断病原菌对药物的敏感性。

2 结果

2.1 分离优势菌株 观察病蛙体表并无明显病灶，但上肢及大腿根部出现了损伤以及不同程度的肿大现象。无菌条件下对病蛙进行剖检，使用接种环划线分离培养脏器中的病原菌。挑选形态不同的优势菌株接种于培养基中划线培养，结果得到5株优势细菌，分别命名为R1、R2、R3、R4和R5。

2.2 细菌溶血活性检测 对R1～R5菌株进行溶血活性检测，测量其溶血圈的直径，结果显示：R1、R2菌株并无溶血活性；R3、R4、R5菌株均出现了溶血环，表明R3、R4、R5菌株均具有溶血活性。

2.3 动物回归试验 使用PBS将R3、R4、R5三株细菌的菌落数统一调至1×108CFU /mL，以100 μL/只的注射量对健康林蛙进行腹腔注射。结果显示，只有注射R5菌株的林蛙出现了死亡现象，注射R1～R4菌株的林蛙均未出现死亡。根据回归试验结果，可以初步证明R5菌株具有较强致病性。

2.4 斑马鱼LD50测定 通过人工感染斑马鱼发现，注射1×106CFU/mL R5菌液的斑马鱼组在第1天就出现了死亡情况，并出现了明显的行动缓慢、精神不振的现象，第2天死亡4尾，1周内死亡率达到80%。经计算，R5菌株对于斑马鱼的LD50达到1.26×103CFU，说明R5菌株具有较强的致病性。

2.5 生理生化鉴定 结果如表2所示，R5菌株可分解葡萄糖产酸产气；可分解赖氨酸脱羧酶、氨基酸脱羧酶；可利用葡萄糖、阿拉伯糖等；不利用明胶、山梨醇等。符合嗜水气单胞菌生理生化特征，判定分离菌为嗜水气单胞菌。

表2 生化反应结果Table 2 Biochemical reaction results

2.6 分子生物学鉴定 对R5菌株的16S rDNA和gyrB基因进行PCR鉴定，测序后构建系统发育进化树。结果如图1和图2所示，分离菌R5与嗜水气单胞菌(GenBank登录号：CP046954.1)的同源性高达98%。结果表明R5菌株与嗜水气单胞菌亲缘关系最近。综合生化反应和分子水平鉴定结果，确定R5菌株为嗜水气单胞菌。

图1 R5菌株16S rDNA系统发育进化树Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA of R5 strain▲：本试验分离的菌株；下同▲：Strain isolated in this experiment. The same as below

图2 R5菌株gyrB系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic tree of gyrB of R5 strain

2.7 毒力基因检测 PCR 扩增结果如图3所示，R5菌株携带6种毒力因子，分别是Lip、act、aer、ser、LuxS和Aha，大小分别为247、232、431、128、369 bp和1 082 bp。

图3 毒力基因的PCR扩增Fig.3 PCR amplification of virulence genesM：DL2 000 DNA Marker; 1：Lip; 2：act; 3：aer;4：exu; 5：ser; 6：LuxS; 7：Aha

2.8 药敏试验 药敏试验结果如表3所示，R5菌株对庆大霉素、四环素、链霉素、氟苯尼考、氧氟沙星、环丙沙星、多黏菌素B、头孢拉啶、头孢噻肟、头孢吡肟、复方新诺明敏感；对丁胺卡那、氯霉素中介；对氨苄西林具有耐药性。

表3 分离菌株药物敏感性试验Table 3 Antibiotic sensitivity test of the isolated strains

3 讨论

嗜水气单胞菌是淡水养殖类动物暴发性传染病的主要病原菌之一，是多种水生动物的原发性致病菌，此前即有水生动物感染嗜水气单胞菌的病例报道[12-13]。由于嗜水气单胞菌的生存条件与蛙类的生活环境极为相似，所以其对蛙类是一种致病力强大的致病菌，主要导致蛙类的皮肤溃烂以及红腿病，进而导致败血症等疾病[14-15]。东北林蛙作为典型的陆生蛙类，在水中繁殖后再登陆入林，其生活环境不仅复杂并且对饲养要求高，极易受到外界环境的影响。由于两栖动物的特殊习性，相较于其他动物更易出现群体间的疾病传播，所以对于其疾病的防控不容小觑[16]。Huys等从出现出血性败血症的虎纹蛙体内分离出1株嗜水气单胞菌，说明嗜水气单胞菌易使蛙类感染致病，蛙类是该菌的主要宿主之一[17]。林蛙常患的疾病大部分具有传染性，但针对林蛙的特效治疗药甚少，所以应重视林蛙的疾病防控，要做到最大程度上减少林蛙染病概率，制定多种疾病治疗方案，才能有效提高林蛙人工养殖的经济效益[18]。

本试验从吉林市养殖场患病林蛙体内分离到5株优势菌株，通过溶血活性检测和动物回归试验分别检测其致病性，结果显示菌株R5对于东北林蛙具有较强的致病性，结合生理生化鉴定初步确定该菌株为嗜水气单胞菌。由于不同来源的嗜水气单胞菌具有不同的理化特性，所以有必要在生化鉴定的基础上进行16S rDNA基因序列的分析鉴定[19]。目前，公认16S rDNA基因检测技术可对微生物进行快速、精准的鉴定分析，是常用于鉴定病原菌的检测方法之一，但由于该方法具有高度保守性，使其对于相似度很高的同属物种的分辨能力较弱[20-21]。RNA聚合酶基因gyrB，与16S rDNA基因相比具有较高的替换率，在以核苷酸序列为基础的细菌类别鉴定中可作为靶分子，有助于更加准确地确定种属分类以及新物种的发现，可更准确地区分同源性较高的亲缘物种[22-24]。因此，本试验选取构建16S rDNA基因和gyrB管家基因的系统发育树，对菌株R5进行后续的分子水平鉴定。结果显示，R5菌株16S rDNA和gyrB基因序列与嗜水气单胞菌(GenBank登录号：CP046954.1)的同源性高达98%，进一步确定嗜水气单胞菌是引起该养殖场东北林蛙患病的病原菌。

动物回归试验和斑马鱼LD50测定结果显示，经人工感染纯化后的R5菌株，可使东北林蛙和斑马鱼在短时间内死亡，证明该菌具有较强的致病性。嗜水气单胞菌与其他病原微生物的致病过程基本一致，大致分为黏附、入侵、定植、增殖、产生毒素，其利用不同毒力因子调节自身的基因，从而来适应不同的要求[25]。一般认为，嗜水气单胞菌致病作用与其携带的多种毒力因子(外毒素、胞外蛋白酶、黏附素)密切相关，可能是多功能和多因子相互协同作用的结果，毒力基因分布不同的菌株，致病性也存在一定的差异[26-28]。本试验毒力因子检测结果显示，R5菌株可携带Lip、act、aer、ser、LuxS、Aha这6种毒力因子。嗜水气单胞菌所产生的气溶素和细胞毒性肠毒素，已被确定为主要的致病因子[29-30]，二者为典型的外毒素，具有肠毒性、溶血活性、细胞毒性等生物学特性，与动物出血病和败血症有关。气溶素作为一种水溶性蛋白质，可在细胞表面形成具有通道孔的七聚体，导致细胞死亡，表现出血症状[31]，与本试验林蛙体表出现红肿的结果一致。丝氨酸蛋白酶广泛存在于原核和真核细胞中，可以参与菌体的一些生化反应，进而影响菌株的毒力。研究发现，丝氨酸蛋白酶的表达与气溶素的表达呈现正相关的关系[32-33]。LuxS基因可以促进细菌生物膜的形成，进而影响黏附能力以及溶血活性，使细菌的感染能力增强[34]。脂肪酶在激活气单胞菌的气溶素活性、增强细菌在宿主细胞中黏附能力等方面均具有重要作用[35]。当嗜水气单胞菌侵袭机体时，其会在体内快速、大量繁殖，所产生的毒力因子单独或协同作用，导致机体内细胞破坏，从而导致机体抵抗力降低，出现出血、败血等病症，严重时可引起死亡[36]。因此，进一步研究嗜水气单胞菌的致病机制对于该菌的防治具有重要的意义。

目前关于嗜水气单胞菌疫苗的研究已经有了显著的进展，但由于制作成本以及技术等方面的原因，在水生动物细菌性疾病的防治中，传统药物和抗菌药物依旧是常用的方法之一[37]。王闯等的药敏试验结果显示，东北林蛙源嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类、氨基糖苷类抗菌药以及部分头孢类药物敏感[38]，与本试验结果基本一致，可见东北林蛙感染嗜水气单胞菌可使用庆大霉素、环丙沙星、头孢拉啶等药物尝试治疗。但菌株R5对于氨苄西林耐药，说明此次引发东北林蛙致病的病原菌具有较高的耐药性，可能与曾长期使用或不科学使用抗菌药，导致该病原菌株产生多重耐药性相关。由于近年来水产养殖产业中滥用抗菌药的现象层见迭出，其所导致的水环境污染以及大量耐药菌株的产生成为了科研人员与养殖户所要面临的严峻问题[39]。所以在养殖过程中要有针对性地选择敏感性药物，并交替使用不同类别的抗菌药物，尽可能避免抗药菌株的产生。利用抗菌药对感染嗜水气单胞菌的蛙类进行治疗只是权宜之计，嗜水气单胞菌的防治仍需不断地进行探索和改进，需要“以防为主，防治结合”的综合防治方法[40]。寻找替代抗菌药物的相关研究也成为了当下水产养殖业对动物疾病防治的重要研究方向，这也对我国绿色健康的水产养殖环境的形成有着重大的意义。