弥漫性大B细胞淋巴瘤患者组织中CXCL9、CXCR3表达与临床病理特征及预后的关系*

冉岑霞 刘思恒 李佳 彭贤贵 张洪洋

(陆军军医大学第二附属医院·新桥医院 1.血液科；2.血液病医学中心，重庆 400037)

弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是原发于淋巴结或淋巴组织的恶性肿瘤，占中国非霍奇金淋巴瘤的50%，且30%DLBCL是难治性或者在治疗后易复发[1-2]。研究发现，趋化因子可通过与靶细胞膜上的趋化因子受体特异性结合使靶细胞产生定向迁移作用，对靶向抑制肿瘤细胞转移侵袭可能有积极意义[3-4]。趋化因子CXCL9是ELR-阴性CXC趋化因子亚家族成员之一，可被干扰素-γ(IFN-γ)诱导产生，CXCL9与其受体CXCR3结合，可聚集CXCR3+细胞，如效应T细胞、调节性T细胞(Tregs)等[5-6]。有研究发现，CXCL9、CXCR3在急性皮炎患者的皮损中表达上调[7]；利用动物实验研究发现急性皮炎纤维化依赖于CXCL9和CXCR3，二者可能参与急性皮炎的发病机制[8]。最近一项研究报道称，肿瘤相关树突细胞(TADCs)可产生高水平的CXCL9并降低其抗原性以诱导T细胞增殖[9]。CXCL9、CXCR3在DLBCL中的作用较少见报道，因此本研究通过检测DLBCL肿瘤组织中CXCL9、CXCR3表达水平与患者病理特征的关系，初步讨论其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年1月～2016年1月在我院采用R-CHOP化疗方案治疗的92例DLBCL患者，均通过淋巴结活检获取DLBCL肿瘤组织标本，及50例病灶旁正常淋巴组织标本。标本均用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4℃保存。92例患者中男性51例，女性41例，年龄24～83岁，平均(55.69±7.12)岁；原发部位：腹股沟淋巴结39例，胃肠道27例，颈部17例，其他9例；Ann Arbor分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期19例，Ⅲ期35例，Ⅳ期24例；组织学分型：生发中心型52例，非生发中心型40例。所有患者均为首次治疗，无合并其他肿瘤，无严重心、肝、肾等功能异常者；临床资料完整。Ki67阳性率≤70% 45例，>70% 47例；乳酸脱氢酶水平正常27例，升高65例；国际预后指数(IPI)评分0～2分56例，3～4分36例。患者及家属均已签订知情同意书，本研究获得本院伦理委员会批准(批准文号：1412-1601)。

1.2 方法

1.2.1 数据库分析 GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是由北京大学团队开发的数据库，是一个癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据分析和可视化的网站。基于该数据库，统计分析CXCL9、CXCR3 mRNA在淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)组织及正常淋巴组织中的差异性表达。

1.2.2 免疫组织化学染色法检测CXCL9、CXCR3蛋白水平 将保存的石蜡组织标本连续4 μm切片，脱蜡后进行梯度乙醇脱水，使用枸橼酸钠溶液进行抗原修复。一抗采用羊抗多克隆抗体试剂盒(美国Sigma公司)，室温孵育30 min后磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，加入二抗孵育。二氨基联苯胺(DAB)溶液染色，苏木素复染，风化、脱水、透明、封片。利用PBS代替一抗作为阴性对照。染色结果由两位病理科专业医师采用双盲法进行读片，采用半定量评分系统进行结果评定。随机取5个高倍镜视野，用2种评分体系评分后取平均值：①按染色强度评分：无染色为0分，浅黄色为1分，淡黄色或黄棕色2分。②按阳性细胞百分比评分：无阳性细胞记0分，≤25%记1分，26%～50%记2分，>50%记3分。将两种评分方法所得评分相乘，乘积≥2分定义为表达阳性(+)，<2分定义为表达阴性(-)；同时定义得分乘积≥3分为高表达，<3分为低表达。

1.3 随访与观察 DLBCL患者开始化疗时即纳入观察，采用门诊复查或电话、短信等方式随访5年，最终随访时间为2021年1月1日，并获得全部患者随访记录。其中复发患者54例，未复发患者38例，分析肿瘤组织CXCL9、CXCR3蛋白表达与患者复发的关系。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0软件进行数据分析，计数资料以n或(%)表示，采用2检验分析CXCL9、CXCR3蛋白表达与DLBCL患者临床病理特征的关系；采用Kaplan-Meier法分析CXCL9、CXCR3蛋白表达水平与DLBCL复发的关系；采用COX回归分析影响DLBCL患者复发的危险因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CXCL9、CXCR3基因在DL-BC肿瘤组织和正常淋巴组织中的表达情况 分析TCGA数据库中47例DL-BC肿瘤组织和337例正常淋巴组织中CXCL9、CXCR3基因的表达水平，结果显示CXCL9、CXCR3基因在DLBCL肿瘤组织中表达水平与正常淋巴组织比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 TCGA数据库中CXCL9、CXCR3基因在DLBCL肿瘤组织和正常淋巴组织中的表达

2.2 CXCL9、CXCR3免疫组化结果及在DLBCL肿瘤组织中的阳性表达 免疫组化结果显示，CXCL9、CXCR3主要定位于细胞质或者细胞膜(见图2)。CXCL9、CXCR3蛋白在DLBCL肿瘤组织中的阳性表达率明显高于其在正常淋巴组织组织中的阳性表达率(P<0.05)，见表1。

表1 CXCL9、CXCR3蛋白在DLBCL肿瘤组织和正常淋巴组织中的表达情况比较[n(×10-2)]

图2 CXCL9、CXCR3蛋白在DLBCL肿瘤组织和正常淋巴组织中的染色结果(SP, 200×)

2.3 DLBCL肿瘤组织中CXCL9、CXCR3蛋白的表达关系 本研究结果显示，CXCL9蛋白与CXCR3蛋白共表达阳性DLBCL患者46例，共表达阴性DLBCL患者21例，仅CXCL9蛋白阳性表达的DLBCL患者14例，仅CXCR3蛋白阳性表达的DLBCL患者11例，差异有统计学意义(2=15.836，P<0.001)，见表2。

表2 DLBCL肿瘤组织中CXCL9、CXCR3蛋白的表达关系

2.4 CXCL9、CXCR3蛋白表达水平与DLBCL患者临床病理特征的关系 CXCL9、CXCR3蛋白表达水平与DLBCL患者年龄、性别、原发部位、乳酸脱氢酶水平、IPI评分无关(P>0.05)，与Ann Arbor分期、组织学分型、Ki67阳性率有关(P<0.05)，见表3。

表3 CXCL9、CXCR3蛋白表达水平与DLBCL患者临床病理特征的关系

2.5 CXCL9、CXCR3蛋白表达水平与DLBCL复发的关系 DLBCL患者肿瘤组织CXCL9高表达组5年累积复发率明显高于低表达组，差异有统计学意义(68.52%vs36.84%,2=9.788，P<0.001)；CXCR3高表达组5年累积复发率，明显高于低表达组，差异有统计学意义(73.68%vs28.57%,2=17.610，P<0.001)，见图3。

图3 CXCL9、CXCR3蛋白表达水平与DLBCL复发的关系

2.6 影响DLBCL患者复发的危险因素分析 单因素分析结果显示，CXCL9、CXCR3、Ann Arbor分期、组织学分型、Ki67阳性率是影响DLBCL患者复发的危险因素(P<0.05)；多因素分析结果显示，CXCL9高表达、CXCR3高表达、Ann Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期、非生发中心型是影响DLBCL患者复发的独立危险因素(P<0.05)，见表4。

表4 影响DLBCL患者复发的危险因素分析

3 讨论

DLBCL是一种常见的侵袭性淋巴瘤，由于淋巴系统的分布特点，使得淋巴瘤成为一种全身性疾病，几乎可侵犯到全身的任何组织和器官[10-11]。DLBCL的发病机制和原因尚不明确，患者确诊时大多已处于晚期，治疗效果及药物耐受性均较差，严重威胁患者生命健康。近年来，生物标志物在肿瘤早期诊断及复发中的作用研究成为热点。

趋化因子是一类诱导趋化、促进免疫细胞分化、引起组织外渗的蛋白质，其在肿瘤环境中的抗肿瘤免疫反应作用越来越引起人们关注[12]。CXCL9是一种被IFN-γ诱导产生的单核因子，可在炎症条件下由肿瘤微环境中的髓细胞产生；另外CXCL9介导淋巴细胞和各种免疫细胞，包括活化的T细胞和自然杀伤细胞，并已被证明在免疫检查点疗法中发挥作用[13]。Razis等[14]研究发现，趋化因子CXCL9与乳腺癌亚型和不良预后相关，可作为乳腺癌患者预后的生物标志物。DLBCL的发生、发展受多种因素、多条信号通路调节[15]，CXCL9在DLBCL中的作用方式和机制尚未阐明。Cheng等[16]报道称，CXCL9在DLBCL组织和细胞系中均呈高表达，并与患者临床进展和较短总生存期密切相关，且其以β-catenin蛋白依赖的方式促进肿瘤进展，这为CXCL9作为DLBCL肿瘤的潜在治疗靶点提供依据。本研究首先利用TCGA数据库查询可知，CXCL9基因在淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中表达水平高于正常组织，利用免疫组化染色结果显示，CXCL9蛋白在DLBCL肿瘤组织中的阳性表达率明显高于正常淋巴组织，免疫印迹法进一步证实CXCL9蛋白表达水平在肿瘤组织中表达上调，表明CXCL9在DLBCL中发挥癌基因作用，可能参与DLBCL肿瘤的发生发展进程。进一步分析结果显示，CXCL9蛋白水平与DLBCL患者Ann Arbor分期、组织学分型、Ki67阳性率有关，与患者年龄、性别、原发部位、乳酸脱氢酶水平、IPI评分无关，Ann Arbor Ⅲ～Ⅳ期、非生发中心型、Ki67阳性率>70%的DLBCL患者肿瘤组织CXCL9高表达占比更高。国内学者龚予希等[17]研究发现，DLBCL患者分期Ⅲ～Ⅳ期、IPI评分3～5分是DLBCL患者发生复发的危险因素，与本研究结果稍有差异，推测可能与地域因素、检测方法、纳入病例数等有关。后续应扩大样本量，进一步开展多中心、前瞻性研究以对本研究结果进行验证。

研究发现，CXCL9、CXCL10、CXCL11/CXCR3轴可调节免疫细胞迁移、分化和激活，导致肿瘤抑制(旁分泌轴)，然而也有研究报道该轴参与肿瘤的发展、转移(自分泌轴)[18-20]。CXCL9可以直接作用于表达CXCR3受体的肿瘤细胞，促进细胞迁移和上皮间质转化[21-22]。Bai等[23]的最新一项研究利用基因表达谱交互分析评估DLBCL和桥本甲状腺炎的重叠差异表达基因(DEGs)，结果显示鉴定出的15个基因中CXCR3在DLBCL中表达高于正常组织，与本研究结果一致。本研究利用TCGA数据库可知，CXCR3基因在DLBCL肿瘤组织中的表达水平明显高于正常组织，其免疫组化结果显示CXCR3蛋白阳性表达率在DLBCL患者肿瘤组织中表达升高，主要表达于细胞质或细胞膜，其表达水平与患者Ann Arbor分期有关，表明CXCR3表达上调参与DLBCL发展进程，发挥癌基因作用。另有研究发现，致表皮B细胞淋巴瘤的CD20阳性肿瘤细胞表达CXCR3，与其特异性配体结合可能导致患者病情进展缓慢，提示CXCR3在不同类型B细胞淋巴瘤中可能与其配体结合发挥不同的生理作用[24]。本研究结果显示，CXCR3蛋白在DLBCL肿瘤组织中表达水平明显高于正常淋巴组织，其表达水平与肿瘤Ann Arbor分期、组织学分型、Ki67阳性率有关，Ann Arbor Ⅲ～Ⅳ期、非生发中心型、Ki67阳性率>70%的患者肿瘤组织中CXCR3高表达人数占比更大，表明高水平的CXCR3与肿瘤细胞迁移、浸润及增殖活性有关。进一步分析患者预后发现，高水平CXCL9、高水平CXCR3的DLBCL患者复发率明显升高；COX回归分析结果显示CXCL9高表达、CXCR3高表达、Ann Arbor Ⅲ～Ⅳ期、非生发中心型时，DLBCL患者5年复发的风险增加，表明CXCL9、CXCR3可能成为DLBCL患者5年复发的潜在指标。

4 结论与启示

趋化因子CXCL9及其受体CXCR3在DLBCL患者肿瘤组织中高表达，且二者表达存在一定相关性，表明CXCL9、CXCR3可能共同作用参与DLBCL发生发展过程，高水平的CXCL9、CXCR3提示DLBCL患者5年复发风险增加，为临床指示DLBCL患者预后提供潜在生物指标。