环介导等温扩增技术检测柔嫩艾美耳球虫二氢蝶酸合酶N377D突变

耿天天,王雅乐,罗莉妍,申 邦,,方 瑞,胡 敏,,赵俊龙,,周艳琴,*

(1.华中农业大学 动物医学院 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070；2.湖北省预防兽医学重点实验室，湖北 武汉 430070)

目前，环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术已开发出用于检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的创新应用[1]。在对疾病进行临床诊断和经验治疗时，正确识别病原体基因型的某些特征对疾病的控制和治疗有很大帮助[2]。鸡球虫病是一种严重危害养鸡业发展的家禽疾病，临床上常由多种不同类型的鸡球虫病病原体引起[3]。近年来，对鸡球虫病流行情况进行了大量研究，而柔嫩艾美耳球虫常被认为是分布更广、致病性更强的物种[4]。由于预防和治疗费用相对较低，因此在预防方面更常使用抗球虫药，然而，随着抗球虫药物的广泛使用，鸡球虫逐渐产生耐药性[5]。磺胺类药物是一类受耐药性影响严重的临床常用药物。在1948年，发现球虫对磺胺类药物具有抗药性[6]。此后，许多学者将注意力集中在磺胺类药物耐药性检测方法的研究上。传统的磺胺类药物耐药性是通过耐药性相关的鸡体笼养试验来检测得以实现[7]。尽管这是检测抗球虫药物的主流方法，但耐药性检测工作量大，检测周期长。因此，采用分子检测方法快速检测磺胺类药物耐药性对家禽业大有裨益，而这可以通过LAMP方法实现。

在顶复门原虫中，对磺胺耐药性碱基突变的研究很少。据报道，其二氢叶酸合酶(dihydrofolate synthase,DHFS)407 位的氨基酸突变与弓形虫的磺胺抗性有关，该位点的氨基酸从天冬酰胺突变为天冬氨酸，即N407D[8]。在鸡球虫磺胺耐药性的研究中，龚振兴等[9]推测耐磺胺类药物的柔嫩艾美耳球虫的焦磷酸激酶-二氢蝶酸合酶(PPPK-DHPS)的第403位可能与耐药有关，该位点的氨基酸由天冬酰胺突变为天冬氨酸，即N403D。结合前人的相关研究，本试验选取含有突变二氢蝶酸合酶(DHPS)的柔嫩艾美耳球虫基因片段，即DHPS的部分基因片段(2 713 bp)。通过焦磷酸测序比对，发现1 129位的碱基突变，即A～G(第1 129位)，代表第377位氨基酸由天冬酰胺突变为天冬氨酸，即N377D。因此，突变位点引起的氨基酸置换(N377D)极有可能与柔嫩艾美耳球虫的磺胺抗性有关，因此该方法的建立为快速筛选含有单核苷酸多态性(SNP)(A1129G)的艾美球虫提供了可能。在本研究开发并优化了一种LAMP方法，可以准确地鉴别柔嫩艾美耳球虫DHPS基因上N377D氨基酸取代的SNP(A1129G)。

1 材料与方法

1.1 试验用虫株和基因组从中国湖北省和河南省的8个不同地理区域收集新鲜鸡粪便。从粪便样品中获得的鸡球虫卵囊通过饱和食盐水漂浮法进行纯化，而后将孢子化的卵囊4℃保存。提取基因组DNA，孢子化的卵囊用去离子水洗涤 3 次，在带有裂解珠的快速样品制备装置(美国MP公司产品)中涡旋卵囊壁 3 次以释放孢子体，加入 20 μL(20 g/L)蛋白酶 K。随后，将混合物在 56°C 下孵育 8 h，并按照制造商的说明使用基因组 DNA 试剂盒(天根生化科技北京有限公司产品)提取 DNA。最后，将基因组DNA样品-20℃保存。Eimeriaacervulina、Eimerianecatrix和Eimeriamaxima的 gDNA 来自中国农业大学。

1.2 引物设计野生虫株中编码DHPS基因的核苷酸在位点 1 127～1 129的 N377WT 的氨基酸序列由 AAC 密码子编码，而 N377D 由突变分离株中的 GAC(N377D)密码子编码。LAMP引物组主要设计用于靶向特定核苷酸 N377WT。基于柔嫩艾美耳球虫的DHPS基因(GenBank登录号XM_013372551.1)，使用Primer explorer V4软件程序(http://primer explorer.jp/e)设计4个特异性LAMP引物(2个内部引物和2个外部引物)。有关引物名称和序列信息见表1，图1。

表1 LAMP中用于检测柔嫩艾美耳球虫DHPS基因N407D突变的引物序列

图1 LAMP引物的靶序列

1.3 LAMP反应体系LAMP检测为25 μL体系，含有10×Buffer 2.5 μL、MgSO41.5 μL、dNTPs 3.5 μL、甜菜碱4.0 μL，每个内引物(FIP/BIP)4.0 μL、每个外部引物(F3/B3)0.5 μL、Bst DNA聚合酶(New England Biolabs公司产品)1.0 μL、模板DNA 1.0 μL和ddH2O 2.5 μL。反应液(Bst DNA聚合酶除外)95℃变性10 min，冰上冷却1 min，加入Bst DNA聚合酶，68℃孵育60 min，80℃加热10 min终止反应。最后，反应产物用1.5% 琼脂糖凝胶电泳分析。

1.4 LAMP的优化LAMP在不同MgSO4浓度(1.0～2.5 mmol/L)、温度(60～69℃)、反应时间(10～60 min)和内/外引物浓度比(1∶1～16∶1)下进行优化。最后，通过凝胶电泳评估LAMP产品。

1.5 LAMP基因型的特异性检测在优化的LAMP反应条件下，以N377D突变株和N377WT的DNA为模板，测试LAMP引物的基因型特异性。

1.6 LAMP检测临床样品以中国两个不同种群的46份鸡球虫样本进行可行性评估，这些样本在本课题组之前的研究中已有报道[3,7]。

2 结果

2.1 LAMP反应的结果凝胶电泳显示出典型的阶梯型图案，证明反应特异性良好(图2)。

M.DL2000 DNA Marker;1.N377D突变株;2.阴性对照

2.2 引物的特异性从球虫gD中扩增LAM产物，但未从Eimeria.acervulian、E.necatrix、E.maximaToxoplasmaGondii.-me49、TgRH△HX或ddH2O中扩增出产物(图3)。此外,序列分析显示在N377D突变株(G)或N377WT柔嫩艾美耳球虫(A)的预期位置处有1个单峰，而在N377D突变株和N377WT柔嫩艾美耳球虫混合株中的同一位置有2个峰(A和G)(图 4)。这些观察结果表明，扩增产物是柔嫩艾美耳球虫的DHPS靶区，LAMP法具有良好的特异性。

M.DL5000 DNA Marker；1.具有点突变 N377D的基因组DNA;2.堆形艾美耳球虫-gDNA;3.毒害艾美耳球虫-gDNA;4.巨型艾美耳球虫-gDNA;5.弓形虫-me49-gDNA;6.弓形虫RH△HX-gDNA;7.dH2O

G.具有点突变N377D的基因组DNA;A.点突变N377W的基因组DNA;G&A.基因组 DNA 与点突变 N377D 和 N377WT(A 和 G)的混合;ETH00013125.柔嫩艾美耳球虫的DHPS基因(ToxoDB登录号ETH00013125)

2.3 LAMP反应优化的结果最佳反应条件显示为1.5 mmol/L MgSO4，内/外引物比为 8∶1，反应温度为68℃，反应时间为 60 min(图 5～8)。

M.DL5000 DNA Marker；1～5.1.0,1.5,2.0,2.5 mmol/L;5.具有点突变 N377WT的基因组DNA;6.ddH2O

M.DL5000 DNA Marker；1～5.1∶1～16∶1;6.具有点突变 N377WT的基因组DNA;7.ddH2O

M.DL5000 DNA Marker；1～6.64～69℃;7.ddH2O

M.DL5000 DNA Marker；1～6.10～60 min；7.阴性对照

2.4 LAMP反应的特异性通过上述最佳条件下的反应证实LAMP方法的特异性，用以区分 N377D 突变株与 N377WT 株(图 9)。

M.DL5000 DNA Marker；1.阴性对照;2.具有点突变N377WT的基因组DNA;3.具有点突变 N377D基因组DNA

2.5 LAMP反应的灵敏度结果显示，对耐药虫株的最低检测限达40 μg/L(图10)。

M.DL5000 DNA Marker；1.40 mg/L;2.4 mg/L;3.400 μg/L;4.40 μg/L;5.4 μg/L;6.400 ng/L;7.40 ng/L

2.6 应用LAMP反应检测临床样品通过测试艾美球虫田间样品验证所建立的LAMP方法可行性。在测试46个现场样品中有43个被确定为阳性(表 2)。

表2 河南、湖北两省田间样品的柔嫩艾美耳球虫二氢蝶酸合酶(DHPS)基因N377D SNP突变检测结果 个

3 讨论

LAMP方法常用于检测SNP[10]，由于其分析速度快、操作简单、成本低，但与简单的 PCR 相比，它需要更多的条件优化，也在一定程度上限制了其应用。LAMP方法使用Bst DNA 聚合酶，该酶缺乏3′→5′ 实时校正活性来区分碱基A～G(第 1 129个)进行基因分型。因此，该方法的关键在于引物设计和靶基因大小的选择性控制。本研究在300 bp大小靶基因片段经过多次探索后发现，在引物FIP碱基突变位点的前2个位置引入G和T错配可以提高方法的特异性。

同时，还评估了该方法的其他变量。由于退火温度对方法建立的影响较大,先探讨退火温度，然后再探讨合适的退火温度下的其他反应条件，如内、外引物的最佳浓度比。本研究尝试了多组引物梯度，发现在8∶1的工作浓度比下特异性达到最强。LAMP方法的灵敏度通过多重稀释法进行评估，其对耐药虫株的最低检测限达到40 μg/L，可以满足临床样品检测的灵敏度要求。

DHPS基因中的N377D的SNP 很可能与磺胺类药物抗性有关[9]。在本研究中结构模型揭示了耐磺胺突变N377D和N377WT 之间的明显差异，这可能为宿主特异性提供分子解释。该模型显示含有 N377D 的蛋白的活性口袋相对N377WT的口袋是“封闭的”(图 11)。

图11 柔嫩艾美耳球虫 DHPS 野生型(A)和抗性突变体中氨基酸 377(B)的关键结构变异

本研究推测Asn-377残基可能在DHPS催化和蛋白结构中起关键作用，这也得到了DHPS蛋白活性测试的很好支持。因此，该方法的建立为筛选突变株提供了极大的便利，也为后续研究该突变与磺胺耐药性的相关性创造了更好的条件。综上所述，所建立的LAMP方法具有特异性高、灵敏度高、简便易行等优点，可用于我国柔嫩艾美球虫N377D突变株的检测。虽然该方法目前只针对引起氨基酸取代(N377D)的SNP(A1129G)进行检测，但该SNP 极有可能与柔嫩艾美耳球虫对磺胺类药物的耐药性有关，因此该方法为后续筛查含有单核苷酸多态性SNP(A1129G)的柔嫩艾美耳球虫提供了良好的条件。