牛源嗜麦芽寡养单胞菌的分离鉴定、毒力、耐药基因及生物学特性分析

任雨龙，李畅洋，孙 愉，张 昊，魏 笑，高炳南，王秋菊

(1.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319)

嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia,SMA)，属于黄单胞菌科，寡养单胞菌属，是一种严格需氧，能够感染人和动物的致病菌。该菌通常能够引起奶牛的呼吸道感染、败血症、心内膜炎和菌血症等[1]。临床表现为采食量、产奶量下降，高热，呼吸急促同时伴有神经系统症状，严重的会引发多器官衰竭，甚至死亡[2-3]。

随着抗生素在畜牧养殖中的广泛应用，SMA的耐药性给感染后的治疗带来了极大的困难。由于该菌在动物临床上的致病性不如其他病原体，故对其生物学特性、存在的毒力和耐药基因，以及耐药表型的研究报道少见[4]。目前，关于猪源、人源和鱼源SMA的研究均有报道，但关于牛源SMA的试验研究较少[5-7]，且并未对该菌的毒力、耐药等特性进行系统分析，临床上参照猪源或人源等分离菌株的生长特性以及耐药特性等信息，对奶牛SMA感染进行防治，不具有充分的指导意义。

因此，为进一步了解牛源SMA的生化特性、毒力和耐药特征，本试验通过从荷斯坦奶牛瘤胃内分离出目标菌株，并对其生长特性和耐药表型等信息进行分析，旨在丰富牛源SMA的生物学信息特征，为科学防治SMA的感染以及合理用药提供帮助，以期减少SMA感染所带来的经济损失，增加奶牛养殖业的生产效益。

1 材料与方法

1.1 样品采集在黑龙江省大庆市某规模化养殖场选取12头荷斯坦奶牛，其中高产奶牛6头，健康状况良好，采食量正常。低产奶牛6头，呼吸急促，采食量相对较少。一共采集12份瘤胃内容物，置于37℃泡沫保温箱中保存，迅速带回实验室进行后续试验，采样奶牛信息如表1所示。

表1 采样奶牛信息

1.2 主要试剂与仪器血琼脂基础2号(HB6230)、MH肉汤(NB6231)、MH琼脂(HB6232)、LB肉汤(HB0128)、胰酪大豆胨琼脂培养基(HB0177-1)购自青岛海博公司；Taq Master Mix、DL2000 DNA Marker、琼脂糖购自TaKaRa公司；细菌DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；氨苄西林、红霉素、克拉霉素等14种药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；质控菌株嗜酸乳杆菌ATCC4356购自广东微生物菌种保藏中心。

1.3 细菌的分离培养将瘤胃内容物使用无菌医用纱布过滤掉饲料残渣，为了后期方便挑取菌落，用生理盐水稀释至不同的浓度(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8)，取10-6，10-7，10-83个浓度在血平板上均匀涂布，置于37℃常规恒温培养箱中培养，每组3个重复。每隔12 h进行挑菌操作，将菌落用划线法接到新培养基平皿中，重复此步骤4～5次，直至平皿中菌落完全相同，没有杂菌。

1.4 DNA提取及测序取分离纯化后的菌液，利用DNA提取试剂盒提取细菌DNA，添加细菌通用引物，进行PCR扩增，其中上游引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物序列：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。预期扩增产物目的基因大小为1 500 bp左右，引物由上海生物工程公司完成[8]。

25 μL反应体系：Premix Taq 12.5 μL、上下游引物各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。反应程序：95℃ 3 min;95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 延伸30 s，30个循环;最后72℃ 延伸5 min。

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，将符合预期基因大小的样品送至上海生物工程公司进行测序，再将测序结果与GenBank中已经登录的菌株进行同源性比对分析，使用MEGA 7.0软件构建系统进化树。

1.5 生化特性试验将所有分离的纯化菌株接种到硝酸盐还原、甲基红、靛基质、硫化氢、尿素酶等生化特性培养基中，观察结果。培养基的配制以及鉴定方法主要参照《伯杰氏系统细菌学手册》第九版和《微生物学及检验技术实验指导》。

1.6 温度特性结合序列比对与生化特性试验结果，从分离的17株菌中挑出4株SMA进行生化特性分析。从各菌株培养液中抽取20 μL菌液于980 μL LB液体培养基中，以LB液体培养基为对照，置于摇床内150 r/min，分别在32，34，36，37，38，40℃下培养24 h，每个温度做3个重复，利用酶标仪测定D600值，以温度(℃)为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制温度曲线。

1.7 耐酸碱特性同1.3接菌方法，在pH值分别为3，4，5，6，7，8，9的LB培养基中接菌，每个酸碱度做3个重复，置于摇床内150 r/min，培养24 h，测定D600值。以pH值为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制耐酸耐碱特性曲线。

1.8 耐胆盐特性将接种菌液的无胆盐LB培养基作为空白对照组，胆盐浓度分别为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%为试验组，每个胆盐浓度3个重复，置于摇床内150 r/min，37℃，培养24 h后，测定D600值，并以胆盐浓度作为横坐标，培养液吸光度值为纵坐标绘制曲线。

1.9 药敏试验本试验以嗜酸乳杆菌ATCC4356为质控菌株，将各菌株接种到MH肉汤培养基中，培养24 h后，抽取100 μL菌液置于MH琼脂培养基上，均匀涂布。将各类药敏纸片紧密贴于平皿中，倒置培养24 h后，记录抑菌圈直径。药敏结果参照美国临床实验室标准化委员会NCCLS(2013)公布的标准，做出耐药(R)、中介(I)、敏感(S)的判定[9-10]。

1.10 毒力基因测定选择与奶牛常见疾病关系较为密切的毒力基因mrkD、fimH和wabG为检测基因，以添加特异性引物的菌株PCR扩增产物为样品，检测菌株中存在毒力基因的种类[11](表2)。

表2 毒力基因引物信息

1.11 耐药基因的检测参考相关文献[12]，并根据药敏试验结果，从GenBank中检索到有关耐药基因的序列，获得链霉素类、碳青霉烯类、大环内酯类等耐药基因序列信息，利用DNAStar Lasergene 11.0 查找出各基因序列中的保守序列，在NCBI上设计引物，得到6类7种耐药基因的引物序列(表3)。

表3 耐药基因引物信息

1.12 菌株致病性检测选取健康BALB/c小鼠35只，SPF级，4周龄，体质量21～24 g，分为5组，每组7只。对照组小鼠灌喂LB液体培养基，剩余4组分别灌喂浓度为1×1011CFU/mL的SMA PMIK-2-a、PMIK-2-b、PMIK-2-c、PMIK-2-d菌液，灌喂量为300 μL/只，持续灌喂7 d，自由饮水，观察小鼠健康状况[13]。

2 结果

2.1 细菌的分离培养如图1所示，分离菌株在TSA琼脂培养基上呈灰白色，略凸起，圆形的点状菌落。镜检观察，菌体为直或者略弯曲的杆状形态，为革兰阴性杆菌。

图1 分离株在TSA琼脂培养基上的形态(A)及革兰染色结果(B)

2.2 PCR扩增产物检测提取菌株DNA，进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后，发现目的基因片段大小为1 500 bp左右，与预测基因片段大小相符(图2)。

M.DL2000 DNA Marker;1～5.16S rDNA扩增产物

2.3 基因序列比对将测序结果在NCBI的GenBank中进行同源性比对分析，发现所有分离菌株的同源性均在99%以上，初步确定分离菌株为SMA PMIK-2。

2.4 系统发育树利用MEGA7.0软件将测序结果建立系统发育树，进一步证明试验所筛选出来的菌与GenBank比对结果的准确性，同源性达到100%(图3)。

K7为目标菌株序列；发育树节点的数值代表Bookstrap值；编号数值为GenBank数据库的登录号

2.5 生化特性鉴定本研究主要对所分离的17株菌进行革兰染色、硝酸还原、靛基质(吲哚)、产蛋白酶、淀粉酶、尿素酶、接触酶以及发酵葡萄糖、产硫化氢等特性鉴定(表4)。参照伯吉氏系统细菌学手册第9版，检测结果基本符合SMA的生化特性。

表4 分离菌株生化特性鉴定

2.6 温度特性在不同温度条件下，4株SMA PMIK-2的生长状况相似，均在培养温度为38℃时，吸光度值达到最高，即菌群数量达到最大。而随着温度继续升高，菌群数量开始迅速下降，即38℃为PMIK-2的最佳生长温度(图4)。

图4 SMA PMIK-2温度曲线

2.7 耐酸碱特性不同的培养基酸碱度对SMA PMIK-2的生长影响是不同的。当培养基pH在3.0～7.0之间时，PMIK-2的生长数量处于稳定上升的状态。当pH=7.0时，SMA PMIK-2菌群数量达到峰值，若培养基pH值继续增加，菌群数量开始快速降低，说明PMIK-2的最佳生长pH值为7.0(图5)。

图5 SMA PMIK-2耐酸碱特性曲线

2.8 耐胆盐特性随着胆盐浓度的增加，SMA PMIK-2的数量开始下降，当胆盐浓度在0.5%～1.5%时，菌群数量下降较为迅速，继续增加胆盐浓度，菌群数量继续下降。但当胆盐浓度达到2%时，菌群数量依然大于对照组的50%，说明SMA PMIK-2具有较强的胆盐耐受能力(图6)。

图6 SMA PMIK-2耐胆盐曲线

2.9 药敏试验SMA PMIK-2在所使用的14种抗菌药物中，对卡那霉素、头孢氨苄、头孢唑啉、克拉霉素、红霉素、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星高度敏感，对多西环素中度敏感，对链霉素、氨苄西林、四环素、亚胺培南、庆大霉素等药物不敏感(表5)。

表5 药敏试验结果

2.10 毒力基因检测利用琼脂糖凝胶电泳检测SMA PMIK-2的PCR扩增产物，发现fimH、mrkD和wabG3种毒力基因在PMIK-2菌株均被检出(图7)。

M.DL2000 DNA Marker;1.mrkD基因;2.fimH基因;3.wabG基因

2.11 耐药基因检测同2.9检测方法，检测SMA PMIK-2的PCR扩增产物，在PMIK-2的基因中检测到链霉素、碳青霉烯类和四环素类耐药基因，与药敏试验结果相符(图8)。

M.DL2000 Marker;1.AadA1基因;2.BlaSHV-1基因;3.ErmF基因;4.TetD基因;5.TetA基因;6.Sul 1基因;7:GyrA基因

2.12 菌株致病性检测随着灌喂天数以及菌液浓度的增加，小鼠死亡率出现不同程度的上升，灌喂1.0×107,1.0×109,1.0×1011CFU/mL组浓度的死亡率分别为28.6%～42.9%，42.9%～57.1%，71.4%～85.7%。剖检死亡小鼠发现胸腔，肝脏、胃肠道均存在不同程度的出血现象。除LB组外，各组剩余存活小鼠体质量、采食量和饮水量均较灌喂前下降，且精神萎靡，运动能力大幅度下降，出现畏寒扎堆的现象(表6)。

表6 SMA PMIK-2致病性检测

3 讨论

本研究从荷斯坦奶牛的瘤胃内分离到17株SMA PMIK-2，其中高产奶牛组4株，低产奶牛组13株。从中挑选出4株同源性存在差异的PMIK-2，对其生物学特性、耐药性、耐药基因和毒力基因等进行检测分析。

参照伯杰氏系统细菌学手册第9版，分离菌株PMIK-2的生化特性鉴定结果与菌种属基本一致。在本试验中甲基红特性检测结果为阴性，与其他报道结果不一致，说明PMIK-2的生长繁殖不能以葡萄糖为营养原料，这可能是由于菌株来源不同导致的[14-15]。

目前诸多对SMA的研究中，少见对其温度、耐酸碱以及耐胆盐特性的报道。而在本试验中发现PMIK-2的最适生长温度为38℃，最佳生长pH为7.0，具有较强的耐胆盐能力。当胆盐浓度增加到2.0%时，菌群生长数量在对照组的50%以上，说明SMA PMIK-2具有较强的耐受能力，能够通过奶牛瘤胃并在肠道中存活。

有研究发现猪源和人源SMA的耐药检出种类具有相似性，对庆大霉素、氧氟沙星、四环素和氨苄西林均呈现高度耐药性[16]。这可能是因为2种来源的SMA均为革兰阴性菌，且在一些相同种类的抗生素药物的长期作用下，形成了较为相似的耐药谱型[17]。猪源SMA呈现多种药物耐药性是由于养殖场内广泛使用一些磺胺类等药物作为饲料添加剂导致的，而人源SMA的多种耐药性可能是人医临床上对该菌感染的治疗，长期使用多种抗生素药物引起的[18]。人源和猪源SMA的耐药表型与本试验结果略有差异。本试验中SMA PMIK-2仅对链霉素、氨苄西林、四环素、亚胺培南、庆大霉素等药物存在高度耐药性，而对卡那霉素、头孢氨苄、头孢唑啉、克拉霉素、红霉素、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星等抗生素药物高度敏感，这可能是由于奶牛养殖场长期使用的药物与其他地点不同造成的。

在PMIK-2中检出的AadA1、BlaSHV-1和TetD3种耐药基因与药敏试验结果相符。还有研究在SMA的基因中检测到了fim、mrkD毒力基因以及BlaSHV-1和TetD耐药基因，这与本试验结果相同[19]。此外，在PMIK-2的基因中还检出了wabG毒力基因，结合小鼠灌喂试验结果，表明SMA PMIK-2对BALB/c小鼠有较强的致病性。因此，在本试验中，分离PMIK-2菌株数量的差异有可能是2组奶牛生产状况不同的原因之一。

在临床治疗中，通常针对菌株所具有的毒力，以及携带的耐药基因来决定使用药物的种类[20]。因此，在治疗SMA PMIK-2引起的疾病时，使用链霉素、碳青霉烯类和四环素类药物的治疗效果可能不是十分理想。

此外，还有研究发现在SMA的耐药性与耐药基因的检测结果之间存在差异，可能是除基因耐药以外的其他耐药机制引起，比如细菌细胞壁通透性的改变、细菌表达外排泵造成药物的外排等原因[21]。在PCR试验中，模板、试剂和焦磷酸盐分子的聚集等因素也会导致在定量方面结果不够准确，容易产生假阳性或假阴性结果，从而出现耐药基因与耐药表型不一致的情况[16]。

综上所述，SMA PMIK-2的最适生长为38℃，最佳生长pH为7.0，具有较强的耐胆盐能力。其基因中携带毒力基因fimH、mrkD和wabG，以及耐药基因AadA1、BlaSHV-1和TetD。PMIK-2对链霉素、氨苄西林、四环素、亚胺培南、庆大霉素等药物高度耐受，且具有较强的致病性。在奶牛的养殖过程中应当注意SMA PMIK-2的预防以及治疗，在临床治疗时应该避免使用具有耐受性的药物，同时还要注意多种药物合理搭配使用，这样才能避免更多耐药菌株的产生，从而减少SMA感染所带来的经济损失。