胰淀素通过完整神经支配上调CART和nNOS神经元表达

刘昊东，李晓静，潘 登，苟 格，李鹏辉，王 英，李海军，郭永清，王 昆，杜晨光,*

(1.内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区基础兽医学重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；3.内蒙古农业大学 园艺保护学院，内蒙古 呼和浩特 010018；4.内蒙古农业大学 职业技术学院,内蒙古 包头 014109；5.河北省农林科学院 粮油作物研究所，河北 石家庄 050035)

胰淀粉样蛋白沉积物中分离而来的胰淀素(Amylin)，是由37个氨基酸组成的肽类激素[1]。Amylin通过抑食、延缓胃排空速率、抑制胃酸、减少胰高血糖素分泌的方式调节机体能量代谢。其受体广泛分布在中枢神经系统(central nervous system,CNS)延髓最后区(area postrema,AP)、孤束核(nucleus of the solitary tract,NTS)和背外侧背盖核(lateral dorsal tegmental nucleus,LDT)[2]。

可卡因苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript,CART)是高表达中枢神经系统转录物之一，可调节摄食、能量、温度等生理指标[3-4]。研究发现，静脉注射CART能减少食物摄入，减轻体质量[5]，借助金硫代葡萄糖(goldthioglucose,GTG)破坏下丘脑腹内侧核(ventromedial hypothalamic nucleus,VMH)葡萄糖相关神经元后，小鼠表现食欲亢进、肥胖和CART免疫反应性降低[6]。CART敲除鼠也表现为采食量、体质量显著增加[7-8]，说明CART与机体能量代谢稳态关系密切。

神经型一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)在能量调控相关神经元的信号传递中发挥重要作用[9]，食物剥夺可降低nNOS神经元mRNA水平[10]，nNOS分泌的一氧化氮(NO)也可调节其他神经递质释放[11]，说明脑内nNOS表达与能量调控存在功能相关性。

产热是能量调控的重要方式，通过化学去背肩胛棕色脂肪组织(interscapular brown adipose tissue,IBAT)交感神经系统(sympathetic nervous system,SNS)支配，可显著影响动物采食和体质量[12]。此外，SNS也与Amylin抑食和调节IBAT产热关系密切，但CART、nNOS神经元信号是否也参与其中，尚不明确。有鉴于此，本研究拟确定能量相关神经核团中CART与nNOS免疫阳性神经元分布情况，再探究CART、nNOS与Amylin介导能量调控的相关性，进而明晰能量调控是否依赖完整的IBAT产热交感神经系统。

1 材料与方法

1.1 动物饲养C57BL/6J 野生雄性小鼠21只(WT,8～9周龄)购自北京维通利华公司。3只用于免疫荧光检测CART、nNOS神经元信号表达，18只小鼠分为野生型(WT)、假手术(Sham)、去神经支配(Denervation)3组，每组6只。腹腔注射Amylin(Phoenix,017-11,50 ng/g)或等量生理盐水(Saline)2 h后，免疫荧光检测Amylin对脑内特定核团CART和nNOS神经元表达水平的影响。

1.2 去IBAT交感神经支配术如先前研究所述[13]进行IBAT去交感神经支配，即异氟烷麻醉后钝性分离背肩胛脂肪垫，暴露并切断IBAT交感神经纤维(5根)，假手术组仅暴露和轻微触碰，术后动物单独饲养，恢复5～7 d。

1.3 免疫荧光试验腹腔注射Amylin或生理盐水(Saline)后，蠕动泵心肺灌注取材。灌注Saline 2 min 后，转为4%多聚甲醛(pH=7.4,Sigma-Aldrich,158127)继续灌注20 min取全脑。4%多聚甲醛4℃后固定6 h，30%蔗糖脱水。冰冻切片机(Slee MNT,Mainz,Germany)将目标区域切为若干张厚度30 μm 脑片，0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤，4℃一抗孵育24 h；一抗为兔抗CART(1∶2 000,PHOENIX,H00362)和山羊抗nNOS(1∶1 000,Abcam,ab1376)。然后用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗涤脑片3次。二抗Alexa Fluor 647驴抗兔IgG(1∶1 000,Abcam,ab150075)和Alexa Fluor 555驴抗山羊IgG(1∶1 000,Abcam,ab150130)于25℃下孵育2 h。洗涤后，自然风干。脑片在的舒适恒温孵育仪4℃ 300 r/min(Eppendorf ThermoMixerTM C)孵育，以加强抗体效果[14]。同时以含0.4%TritonX-100(Sigma-Aldrich,T8787)的抗体稀释液作为阴性对照。用4和10倍物镜的激光共聚焦显微镜(Nikon,C2 Plus)对脑片进行成像。

2 结果

2.1 小鼠脑内CART、nNOS神经元分布CART的免疫阳性信号已在ARC和PVN区域的绝大部分能量相关神经元细胞中得到证实[15]。这与本试验观察到的nNOS和CART免疫阳性神经元的表达模式吻合。在LDT以及臂旁核(parabrachial nucleus,PBN)区域，同时观察到了nNOS神经元免疫阳性信号的分布(图1G～H)。值得注意的是，在前包钦格复合体(pre-botzinger complex,PrBO)区域中观察到CART以及nNOS免疫阳性信号的广泛分布，但二者并不存在明显共定位(图1 J)。

CART与nNOS的阳性共定位信号在下丘脑隔核(septohypothalamic nucleus,SHy)、杏仁核内侧(medial amygdaloid nucleus,anterior part,MeA)、下丘脑背内侧核(dorsomedial hypothalamic nucleus,DMH)、乳头体前核(premammillary nucleus,PMV)、动眼神经副核(pre-edinger-westphal nucleus,PrEW)、中缝核(Raphe magnus nucleus,RMg)和巨细胞网状核(gigantocellular reticular nucleus,Gi)中观测到(图1A,B,C,D,E,F,I)。矢状面结果进一步确认DMH区域有CART、nNOS共表达信号，以及LDT区域有nNOS免疫阳性神经元(图1K,L)。

A～L.不同核团中 CART、nNOS 免疫阳性神经元表达(红色.nNOS;绿色.CART;黄橙色.CART + nNOS);A,A1.Shy中的 CART 和 nNOS 神经元；B,B1.MeA中的 CART 和 nNOS 神经元；C,C1.DMH中的 CART 和 nNOS 神经元；D,D1.PMV中的 CART 和 nNOS 神经元；E,E1.PrEW中的 CART 和 nNOS 神经元；F,F1.RMg中的 CART 和 nNOS 神经元；G,G1.PBN中的 nNOS 神经元；H,H1.LDT中的 nNOS 神经元；I,I1.Gi中的 CART 和 nNOS 神经元；J,J1.PrBO中的 CART 神经元；K,K1.矢状面DMH中的 CART 和 nNOS 神经元；L,L1.矢状面LDT中 nNOS 神经元。K,L.40 ×；A,B,C,D,E,F,G,H,I,J,K1,L1.100 ×；A1,B1,C1,D1,E1,F1,G1,H1,I1,J1.200×。比例尺:100 μm

2.2 Amylin激活下丘脑DMH区域CART、nNOS神经元为观察Amylin调控作用是否涉及下丘脑CART、nNOS神经元激活，分析了外周注射Amylin后DMH区域CART和nNOS神经元的表达数目。结果显示，与Saline组相比腹腔注射Amylin(50 ng/g)显著增加WT组与Sham组DMH区域CART(control:Saline对比Amylin,P=0.018 3;Sham:Saline 对比Amylin,P=0.021 1,图2A～D,G)和nNOS(control:Saline对比Amylin,P=0.030 8;Sham:Saline对比Amylin,P=0.025 3,图2A～D,H)免疫阳性神经元数目。

去除IBAT交感神经支配后，相比WT组和Sham组，Amylin对于下丘脑CART和nNOS表达数目的促进作用被显著逆转(CART:Saline对比Amylin,P=0.989 5;nNOS:Saline对比Amylin,P>0.999 9,图2E，F,G,H)。

A～F.WT、Sham、Denervation 小鼠注射 Saline和 Amylin后在DMH中 CART 和 nNOS 的免疫阳性神经元表达;G.Amylin(50 ng/g)对WT(P=0.018 3)，Sham(P=0.021 1)和denervation小鼠(P=0.989 5)CART表达的影响；H.Amylin对WT(P=0.030 8)、Sham(P=0.025 3)和Denervation小鼠(P>0.999 9)中nNOS表达的影响。A,B,C,D,E,F.40×；A1,B1,C1,D1,E1,F1.100×；A2,B2,C2,D2,E2,F2.200×。比例尺:100 μm

以上结果提示Amylin的能量调控作用可诱导下丘脑CART和nNOS神经元表达数目显著上升，这种诱导作用依赖于完整的IBAT交感神经支配。

3 讨论

Amylin可调节哺乳动物采食和能量消耗，引发中枢能量调控进程[16]。研究表明，Amylin对IBAT产热具有显著调控作用，LDT是Amylin信号传导直接靶点[17]，提示LDT可发挥潜在的能量平衡作用。本研究发现DMH区域CART和nNOS神经元参与了Amylin诱导的中枢能量调控，且Amylin对CART、nNOS表达调控依赖完整的SNS支配。

先期研究发现LDT区域nNOS参与了由SNS支配的Amylin对小鼠IBAT产热的调控过程，且CART在SHy、MeA、PMV、Gi及其他细胞核中呈阳性表达，nNOS阳性细胞密集分布在LDT附近，说明后脑表达的nNOS及NO衍生氧化物质可调节激酶和磷酸酶活性[18]。根据CART信号与nNOS神经元在第三脑室(3V)附近DMH区域共定位情况，提示CART神经元参与Amylin产热调控。Gi区域nNOS神经元与儿茶酚胺类表达神经元存在共表达，说明nNOS神经元可调控血管收缩[19]。全脑定位证实CART神经元也存在于PrEW、PrBO区域，其功能尚不明晰。CART、nNOS神经元多核团分布，表明其参与了机体能量平衡、血管收缩等多种生理功能的调控。

作为治疗肥胖症的潜在药物，Amylin可通过作用下丘脑调控动物食欲和能量平衡。DMH主要由抑制体质量和食欲的γ-氨基丁酸能(GABA)神经元和nNOS神经元组成[20]，这2种阳性神经元可整合哺乳动物外周器官能量相关信号，调控机体能量代谢进程。有研究报道称，沉默DMH R-spondin 1(Rspo1)可降低ARC中CART表达，减弱胰岛素对食物摄入的抑制作用[21]，表明CART可在Rspo1下游介导胰岛素抑食作用。已知CART可被瘦素激活，进而参与能量调控[22]，且注射Amylin后可显著增强下丘脑CART表达水平，提示，除瘦素外Amylin的能量调控作用也涉及CART神经元介导。尽管Amylin可增强同一区域nNOS神经元表达，但CART与nNOS无共定位关系，说明两者在下丘脑能量调控相对独立。

依赖SNS支配的棕色脂肪组织(bown adipose tissue,BAT)是机体产热的重要来源。RYU等[23]利用IBAT特定多突触逆行追踪技术证明DMH与BAT产热密切相关[23]。LDT信号调节依赖于完整的SNS，这表明中枢神经系统关键核团可向IBAT发送下行投射信号并与采食有关。总之，CNS与交感神经介导的功能调节存在解剖学联系，说明CART、nNOS参与了Amylin介导的中枢能量调控过程。

综上，CART与nNOS在小鼠DMH神经核团中存在共表达，Amylin可显著促进DMH区域CART以及nNOS神经元表达，且该过程依赖完整IBAT交感神经支配参与能量调控。