UPLC-Orbitrap HRMS法同时测定食品接触用纸中23种有机抗菌剂

刘益锋, 邱嘉兴, 张朋杰, 孙克强, 张宪臣, 赵珍玉, 梁润梅

（中山海关技术中心, 广东 中山 528400）

纸质包装由于其原料来源广泛、制造成本低、性能优良、环保等优点在食品产业中得到越来越广泛的应用[1］。在生产加工和存储过程中为了防止食品接触用纸制品霉变, 常使用有机抗菌剂达到防腐、抑菌的效果, 以增加纸制包装和食品的存储和使用期限[2］。氯苯酚类药物通常用于木材的防腐抗菌, 造纸制浆的漂白和氯化消毒过程中也会产生氯苯酚类药物。由于氯苯酚类药物具有致畸变和致癌性, 许多国家均对该类药物的使用进行了严格限制[3］。对羟基苯甲酸酯类具有广泛的抑菌作用及稳定性, 但如果超出规定的安全使用范围, 则可能影响消费者的身体健康[4］。因此, 建立食品接触用纸制品中氯苯酚类和对羟基苯甲酸酯类等有机抗菌剂的检测方法, 开展食品接触用纸制品中有机抗菌剂含量监测, 具有十分重要的意义。

目前, 已有检测对羟基苯甲酸酯类和氯苯酚类物质的标准[5-7］, 主要测定方法有气相色谱法（GC）[8-9］、气相色谱-质谱法（GC-MS）[10-11］、高效液相色谱法（HPLC）[12-13］和液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[14-15］等。现阶段测定有机抗菌剂的前处理条件和仪器分析条件各有特色, 但同时测定上述23种有机抗菌剂少见报道。超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Orbitrap HRMS）拥有定量能力强、分辨率高等优点, 无需对多个目标物的相关参数进行逐一优化, 通过采用母离子的精确分子量直接定量, 可以大大地缩短多个目标物的测试时间, 近年来在食品和工业品中有毒有害化合物的快速检测中得到了广泛使用[16-19］。本研究建立了UPLC-Orbitrap HRMS法同时快速测定食品接触用纸中23种有机抗菌剂, 该方法简单、便捷、实用性强, 适用于食品接触用纸样品的快速筛查与检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UltiMate 3000Q-Exactive高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱UPLC-Orbitrap HRMS, 配有HESIⅡ离子源（美国Thermo Fisher公司）；涡旋震荡器（德国IKA公司）；电子天平（BS323S, 德国赛多利斯公司）；超纯水系统（美国Millipore公司）；S300H超声波水浴（美国CREST公司）。

乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯（HPLC级, 德国Merck公司）；乙酸铵、乙酸（色谱纯, 上海安谱公司）。23种抗菌剂标准品（纯度≥95%, 上海安谱公司）。

1.2 溶液配制

每种标准物质逐一用甲醇配制成1 000 mg/L的标准储备液, 避光在4℃以下保存。准确吸取每种储备液混合后, 用甲醇配制成质量浓度为10 mg/L的标准中间液, 或其他质量浓度的标准中间液。称取0. 385 g固体乙酸铵, 用超纯水溶解并定容至1 000 mL, 配制成5 mmol/L乙酸铵溶液, 摇匀备用。

1.3 色谱-质谱条件

色谱柱：Waters Atlantis T3柱（2. 1 mm×150 mm, 3μm）；流动相：甲醇（A）-5 mmol/L乙酸铵（含0. 4%乙酸）溶液（B）, 梯度洗脱条件：0～15 min, 30%～80%A；15～20 min, 80%A；20～20. 1 min, 80%～30%A；20. 1～25 min, 30%A。流速0. 3 mL/min；柱温40℃；进样量10μL。

电离模式为电喷雾负离子（ESI-）；毛细管电压为-3. 2 kV；离子传输温度为320℃；鞘气压力为40 unit。扫描模式为Full MS/dd-MS2：采集范围为50～500 Da；一级分辨率为70 000, 二级分辨率为17 500, 其他质谱信息见表1。

表1 23种有机抗菌剂的串联质谱参数Table 1 MS/MS parameters of 23 organic antibacterial agents

1.4 样品前处理

将检测样品制成5 mm×5 mm以下碎片, 混合均匀。称取0. 5 g（精确至1 mg）试样放入样品瓶中, 加入10 mL甲醇提取液后混匀, 常温下超声提取20 min, 取出后经4 500 r/min离心5 min, 转移至氮吹仪中吹干。加入1 mL甲醇涡旋溶解, 过0. 22μm滤膜, 待上机测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相的优化

本文测定的23种有机抗菌剂包含19种氯苯酚类化合物和4种对羟基苯甲酸酯类化合物, 其中19种氯酚类化合物中含有4组同分异构体, 即3个一氯苯酚、6个二氯苯酚、6个三氯苯酚和3个四氯苯酚。由于同分异构体间的物理化学性质相似, 色谱行为差异较小, 因此完全分离同分异构体的难度较大。

结合文献报道[3, 15］, 分别在常规的负离子模式下对几种水相和有机相的分离效果进行测试, 其中有机相采用甲醇和乙腈, 水相采用5 mmol/L乙酸铵和添加不同含量乙酸的5 mmol/L乙酸铵。结果发现, 有机相采用甲醇时分离效果和响应强度明显高于乙腈。水相采用5 mmol/L乙酸铵加入酸后的分离效果和响应强度明显增强, 但考虑到酸过多会对色谱柱和管路造成损害, 因此采用甲醇-5 mmol/L乙酸铵（含0. 4%乙酸）作为本方法的流动相。

2.2 色谱柱的选择

分别考察了Atlantis T3（2. 1 mm×150 mm, 3μm）、Atlantis dc18（2. 1 mm×150 mm, 5μm）、uctra AQ c18（2. 1 mm×150 mm, 3μm）色谱柱对23种有机抗菌剂的分离效果。结果表明, Atlantis T3（2. 1 mm×150 mm, 3μm）在优化色谱条件下能使23种有机抗菌剂的色谱峰响应值高且具有较高的分离度, 可最大程度将氯苯酚同分异构体分离。其他2种色谱柱均存在响应值低, 分离效果较差等不足。因此, 本方法最终采用Atlantis T3（2. 1 mm×150 mm, 3μm）对23种有机抗菌剂进行分离（见图1）。可观察到, 2, 3, 4, 6-四氯苯酚和2, 3, 5, 6-四氯苯酚峰完全重叠, 3-氯苯酚和4-氯苯酚、2, 4-二氯苯酚、3, 4-二氯苯酚和2, 5-二氯苯酚等同分异构体峰部分重叠。

图1 4种含对羟基苯甲酸酯类化合物（A）及19种含氯苯酚化合物（B）标准物质的色谱图Fig. 1 Chromatograms of 4 parabens（A）and 19 chlorinated phenols（B）standard solutions the number denoted was the same as that in Table 1

2.3 提取溶剂的选择

有机抗菌剂均可溶于多种有机溶剂。本研究选用甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等溶剂对实际样品进行加标回收实验, 结果显示, 9类分析物（其同分异构体归为1类）的回收率分别为71. 6%～109%、78. 0%～108%、63. 0%～106%、72. 0%～110%（见图2）。数据表明以甲醇和乙腈为提取剂时9类分析物的加标回收率较高。考虑到流动相为甲醇, 本方法采用甲醇作为最终提取溶剂。

图2 提取溶剂对抗菌剂提取效果的影响Fig. 2 Effect of solvents on the extraction of antibacterial agent

2.4 线性范围与定量下限

由于所测定的23种有机抗菌剂中包含多种同分异构体, 液相色谱完全分离的难度大, 结合文献, 本方法确定用同组同分异构体的含量总和进行定量分析[15］。以有3种同分异构体的二氯苯酚为例, 精确分子量均为126. 995 6（m/z）, 对3种二氯苯酚的色谱峰面积进行加和后计算二氯苯酚的总含量。

由于高分辨质谱的基线噪音很低, 不能采用传统信噪比方法计算检出限, 而是采用10倍空白实验的标准偏差除以线性方程的斜率确定定量下限（LOQ）。用甲醇将混合标准中间液稀释成一系列质量浓度梯度的标准工作液, 按“1. 3”条件依次进行测定。结果表明, 9组化合物的色谱峰面积与其质量浓度的线性相关性良好, 相关系数均大于0. 997（见表2）。

2.5 回收率与相对标准偏差

空白基质样品采用不含待测物质的食品接触用纸, 通过添加不同浓度混合标准工作液进行回收率和相对标准偏差（RSD）实验。选取0. 05、0. 5、2μg/kg对羟基苯甲酸酯类和0. 05、0. 5、2 mg/kg氯苯酚类3个不同加标浓度（见表3）, 每个加标水平平行测试6次, 测得9种组分的加标回收率为81. 7%～119%, RSD为2. 0%～8. 8%（见表3）。方法的回收率和RSD在合理范围内, 实际可行。

表3 方法的回收率与相对标准偏差Table 3 Recovery and RSD of the method

2.6 实际样品的测定

收集市场上不同品牌、不同用途的食品接触用纸制品15批次, 利用本方法进行测试。结果显示, 所有样品均未检出氯苯酚类有机抗菌剂, 1批次样品检出对羟基苯甲酸甲酯, 含量为0. 13μg/kg。表明对羟基苯甲酸甲酯在市场上的食品接触用纸制品中有检出, 市场监管部门需要加强对食品接触用纸制品中有机抗菌剂使用的监管力度。

3 结 论

本文采用甲醇为提取溶剂, 超声提取, 建立了超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱同时快速测定食品接触用纸中23种有机抗菌剂的方法。结果显示, 该方法简单、便捷, 可用于食品接触用纸中多种有机抗菌剂的筛查和确证。