孕期砷暴露对子代雄性小鼠精子质量的影响

李雪华，崔金忠，焦鹏娜，章金刚,2*，刘兴友*

(1.新乡学院 生命科学与基础医学学院 动物疫病分子诊断河南省工程实验室，河南 新乡 453003；2.军事医学研究院 卫生勤务与血液研究所，北京 100850)

砷(arsenic,As)是一种普遍存在于地壳中的类金属元素，可通过食物、水、呼吸等途径进入人体，对人类健康造成一定的危害。近年来，砷被证明是内分泌干扰物，能够模仿、阻断或干扰体内的激素，在胎儿、新生儿和成年期间暴露均可干扰生殖器官的发育并影响精液质量和生殖激素的产生[1-2]；且可通过胎盘屏障，导致胎儿在母体内暴露砷，从而对孕妇和胎儿造成不良影响[3-4]。本课题组前期的试验结果发现，孕期砷暴露可导致子代雌性小鼠青春期启动时间提前[5]；另据报道，孕期砷暴露可影响宫内发育，导致自然流产、死产和新生儿体质量下降[6-7]；雄性大鼠饮用水暴露中剂量(50 mg/L)和高剂量(100 mg /L) 的As2O3后，睾丸质量降低，睾丸组织和睾丸内生精细胞受损导致精子质量下降、大鼠生育力低下[8]。但是，孕期砷暴露对子代雄性小鼠精子质量影响的报道较少，故本试验以孕期砷暴露的ICR小鼠为试验动物，分别检测分析子代雄性小鼠不同发育阶段的脏器系数、精子活率、精子畸形率、促卵泡生成素(follicle stimulating hormone,FSH)和促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)的变化情况，探讨孕期砷暴露对子代雄性小鼠精子质量的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器FSH(JM-02838M2)和LH(JM-02865M2)酶联免疫吸附测定试剂盒(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)购于江苏晶美生物科技有限公司；苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色试剂盒(G1120)购于北京索莱宝科技有限公司；As2O3(分析纯)购于中国医药公司北京采购供应站；EnSpise酶标仪购自铂金埃尔默企业管理有限公司；Primo Star显微镜购自Carl Zeiss公司。

1.2 试验动物8周龄的16只雌性和8只雄性ICR小鼠(合格证号11400700026274)购于北京维通利华试验动物技术有限公司。将雌性ICR小鼠随机分为2组(8只/组)：对照组(去离子水组,C组)和砷暴露组(15 mg/L As (Ⅲ)，As组)，饲养于温度(21±2)℃、空气湿度60%～70%及12 h黑暗/12 h光照(每天上午7:00开灯，下午19:00关灯)的环境。适应1周后，各组小鼠每日20:00按雌性∶雄性=2∶1的比例合笼交配(为防止雄性小鼠暴露砷，交配期间20:00～6:00禁止饮水)，次日清晨6:00 检查雌鼠的阴道栓，观察到阴道栓的日期确定为孕期0 d，怀孕后的母鼠单独饲养于标准鼠笼中。

仔鼠出生当天即为出生后0 d，试验组母鼠停止砷暴露，开始饮用去离子水。对仔鼠进行称重并辨别雌雄数目，于21日龄断乳。对照组和试验组子代雄性小鼠分别在5,8,16周龄3个阶段，随机选取6只进行后续试验。整个试验期间小鼠均自由摄取标准颗粒饲料和饮水。

1.3 脏器系数测定小鼠禁食12 h后，称体质量，眼球取血放入无菌EP管中，颈椎脱臼处死，腹部消毒后，在冰浴上快速取肝脏、脾脏、肾脏、睾丸和附睾，称重并计算脏器系数。

1.4 精子活率检测取右侧附睾尾部分，剪碎，置于37℃、1 mL生理盐水中30 min，用胶头滴管反复吹打，制成精子悬液。用微量移液枪吸取10 μL的精子悬液，缓慢移入红细胞计数室内，盖上盖玻片，放置于光学显微镜下，确定目标视野，统计红细胞计数板内5个不同小方格内活精子数与死精子数，根据红细胞计数法公式计算精子活率[9]。

精子活率=(5个小方格活精子数/5×400)/[(5个小方格活精子数+5个小方格死精子数)/5×400]×100%。

1.5 精子畸形率检测微量移液枪吸取10 μL的精子悬液缓慢滴到载玻片上，自然晾干；甲醇固定5 min，然后自然干燥。按照HE染色试剂盒方法进行染色，显微镜下观察畸形精子数(包括头部、尾部和颈部畸形等)，每组随机观察不同视野的精子形态，按公式统计精子畸形率。精子畸形率=畸形精子数/检查精子总数×100%

1.6 血清激素的测定小鼠眼球取血后，先于37℃水浴锅中静置1 h，然后放入4℃冰箱过夜，高速冷冻离心机4℃、3 000 r/min离心15 min，分离血清，并用ELISA试剂盒测定血清中FSH和LH水平。

2 结果

2.1 孕期砷暴露对母鼠产子数及雌雄比例的影响如表1所示，与对照组相比，母鼠孕期砷暴露对其产子数和子代的雌雄比例没有显著影响(P>0.05)。

表1 孕期砷暴露对母鼠产子数及雌雄比例的影响

2.2 孕期砷暴露对子代雄性小鼠脏器系数的影响与对照组相比，砷暴露组子代雄性小鼠5周龄体质量显著上升(P<0.01)，肾脏系数显著下降(P<0.05)；其他各发育阶段的小鼠脏器系数均无显著性变化(表2)，表明孕期砷暴露可对子代雄性小鼠脏器造成一定的影响。

表2 孕期砷暴露对子代雄性小鼠脏器系数的影响

2.3 孕期砷暴露对子代雄性小鼠精子活率的影响取右侧附睾尾制成精子悬液在显微镜下观察，通过细胞计数板计数进行测定，结果见表3，砷暴露组子代雄性小鼠在5周龄和8周龄的精子活率均显著低于对照组(P<0.01，P<0.05)，表明母鼠孕期砷暴露可影响子代雄性小鼠的精子活率。

表3 孕期砷对子代雄性小鼠精子活率的影响 %

2.4 孕期砷暴露对子代雄性小鼠精子畸形率的影响甲醇固定精子，HE染色后显微镜下随机观察不同区域的精子形态进行测定，结果见表4。与对照组相比，8周龄的子代雄性小鼠精子头部畸形率显著升高(P<0.05)，表明母鼠孕期砷暴露可影响子代雄性小鼠的精子畸形率。

表4 孕期砷暴露对子代雄性小鼠精子畸形率的影响 %

2.5 孕期砷暴露对子代雄性小鼠血清激素的影响用ELISA试剂盒分别测定不同发育阶段子代雄性小鼠血清中的FSH与LH含量，结果见图1。与对照组相比，砷暴露组在5周龄和16周龄的FSH水平显著下降(P<0.01,P<0.05)，8周龄略降低，但是无明显变化(图1A)；而3个发育阶段LH水平与对照组相比无显著性差异(图1 B)。

A.对照组及处理组的FSH变化；B.对照组及处理组的LH变化

3 讨论

本试验所用15 mg/L As (Ⅲ) 的砷质量浓度是在项目组前期试验[5]基础上设计的，初衷是以人类健康为基础，模拟人类日常生活的主要摄入方式和剂量。按照世界卫生组织(World Health Organization,WHO)的水砷标准、美国环境保护署(Environmental Protection Agency，EPA)修订的标准及我国国家标准委和卫生部联合颁发的《生活饮用水卫生标准》，饮水砷的安全质量浓度应小于10 μg/L，然而很多地方的实际饮水砷质量浓度远高于该质量浓度，甚至超过5 000 μg/L[10-11]。据报道，某些成年人每天摄入砷的量约为50 μg，且人类对砷的敏感程度为鼠的10～100倍[12]，故本试验确定的砷质量浓度是与人类健康息息相关的。而胎儿和新生儿时期对外界因素的干扰较敏感，可扰乱内分泌信号，进而引起长远的不良后果；所以本试验选择胎儿期作为受试时间，以期为人类的孕期安全防护提供理论支撑。

砷具有生殖毒性，可对机体的生殖健康造成威胁。据报道，砷可蓄积于动物睾丸组织，致睾丸组织萎缩、质量下降、生精细胞损害[8,13]，对精子细胞有致畸作用[13]；通过生殖细胞变性引起睾丸毒性[14]。孕期砷暴露(85 mg/L)导致子代雄鼠精子生成水平降低、畸形率上升和精子活力下降，且宫内砷暴露引起的雄性生殖损伤具有跨代遗传效应[15]。本试验结果表明，砷暴露组的5周龄和8周龄子代雄性小鼠的精子活率与对照组相比均显著下降，8周龄的头部畸形率显著升高；提示孕期低质量浓度砷暴露可影响子代雄性小鼠的精子活率和畸形率。脏器系数是亚慢性毒性试验中检测受试物作用的重要指标，本试验中砷暴露组子代雄性小鼠5周龄肾脏系数显著下降，表明孕期砷暴露可对子代雄性小鼠相关脏器造成一定的影响。另有文献报道，砷可使胎盘屏障功能受损，导致子宫高风险暴露于砷；但健康的胎盘积累可能阻止重金属向胎儿的转运，降低胎儿接触重金属的风险[16]；且砷可通过肾脏和肠道缓慢排出体外[17]。故推测本试验中睾丸质量及其他阶段子代小鼠的脏器系数无显著变化，可能和砷暴露浓度低、机体代谢或胎盘屏障等因素有关。

FSH和LH是睾丸发育和功能所必需的，可调节类固醇激素的合成和配子形成，分别通过刺激间质细胞和支持细胞发挥重要作用[18-19]。LH可控制睾丸间质细胞中睾酮(testosterone,T)的产生，血浆中LH激素的减少会损害间质细胞的功能，导致T生成的减少，从而使附睾精子数量减少[20]。FSH可独立影响支持细胞的增殖、成熟和功能，也可与T协同作用支持细胞产生调节信号和营养物质，以维持生殖细胞的发育[21]。据报道，FSH可通过支持细胞中的膜结合受体为精原细胞向成熟精子细胞的发育提供间接的结构和代谢支持，且在支持细胞的数量和维持精子发生能力方面起着至关重要的作用，FSH或其受体的减少会导致精子发生减少[21-22]。而砷被证明可通过直接作用于雄性腺体或破坏垂体活动而影响雄性生殖，导致间质细胞分泌雄性激素中断，致FSH、LH和T水平降低及生精小管中出现生精上皮细胞层次紊乱[13,23]。另有研究表明，砷可通过提高血浆糖皮质激素水平抑制促性腺激素细胞对促性腺激素释放激素的敏感性及降低雄鼠血清中FSH、LH和T的激素水平[14]。本试验中，母鼠孕期砷暴露后，5周龄和16周龄的子代雄性小鼠FSH水平与对照组相比显著下降，8周龄略下降但无显著变化，与相关文献结论相符；推测精子活力下降及精子发生的抑制可能是由于FSH水平降低引起的。

本试验结果表明，母鼠孕期砷暴露可导致子代雄性小鼠FSH水平下降、精子质量低，影响雄性的生殖健康。但是，具体影响生殖健康的因素较多，如As2O3可诱导小鼠发生氧化应激，阻碍小鼠的精子成熟和精子发生，导致生殖毒性[24]，故母鼠孕期砷暴露影响精子发生机制还需要进一步探究。