牛球虫病的研究进展

叶莉莎，陈 俭，胡 敏

(华中农业大学 动物医学院 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070)

牛球虫病是多种艾美耳球虫寄生在牛肠道引起的消化道原虫病，艾美耳球虫隶属于顶复门、孢子虫纲、球虫亚纲、真球虫目、艾美耳亚目、艾美耳科、艾美耳属。已知感染牛的艾美耳球虫有20多种[1]，其中仅有几种艾美耳球虫是具致病性的，部分艾美耳球虫寄生于宿主而对肠道黏膜不产生较大损害。牛球虫病通常导致受感染犊牛严重腹泻以致大量死亡，给养殖业造成巨大的经济损失[2]。目前，有效的控制球虫病严重依赖于管理措施及抗球虫药物，而药物的长期使用也使耐药性成为了球虫病治疗的潜在威胁[3]。通过对牛球虫病流行情况、诊断、防控等研究现状进行总结，旨在为今后对牛球虫病的综合防控及深入研究提供参考。

1 牛球虫病的病原

牛球虫病的病原为艾美耳球虫，其有极强的宿主特异性。在20多种感染牛的艾美耳球虫中，牛艾美耳球虫(E.bovis)和邱氏艾美耳球虫(E.zuernii)致病性最强，阿拉巴艾美耳球虫(E.alabamensis)、奥博艾美耳球虫(E.auburnensis)和椭圆艾美耳球虫(E.ellipsoidalis)也具有致病性。艾美耳球虫的未孢子化卵囊呈卵圆形或近似圆形，少数呈椭圆形或梨形等。球虫的孢子化卵囊是鉴定虫种的重要依据[1](图1，表1)，卵囊壁有2层，外层是保护性膜，内层由配子发育过程中形成的颗粒构成。原生质团发育后形成4个孢子囊，孢子形成过程中有时有极粒；部分在孢子囊形成后还剩一团颗粒状团块，为卵囊残体；孢子囊为椭圆形、圆形或梨形，每个孢子囊内有2个子孢子；子孢子为香肠形或逗点形，端部有球状的折光体。

图1 部分未孢子化与孢子化牛球虫卵囊[4]

表1 常见牛球虫孢子化卵囊的形态特征

2 生活史

牛艾美耳球虫生活史与鸡艾美耳球虫基本相似(图2)，均为直接发育型，分为外生性发育和内生性发育[5]。外生性发育为孢子生殖，带虫者排出卵囊，未孢子化卵囊在外界适宜环境下，发育为孢子化卵囊。内生性发育包括裂殖生殖和配子生殖，牛吞食孢子化卵囊，卵囊进入消化道后释放出孢子囊，孢子囊在肠腔内受酶、胆汁的作用逸出子孢子，随后侵入肠黏膜上皮细胞，进行裂殖生殖；数次裂殖生殖后，裂殖子有的成为小配子体(雄配子体)，有的成为大配子体(雌配子体)，配子体发育成熟为大、小配子，小配子进入大配子，大配子受精成为合子，表面形成厚壁，合子即变为卵囊[6]。牛球虫在肠道内破坏肠上皮细胞，造成出血性肠炎及溃疡，产生毒素毒害患病牛中枢神经系统，发病乃至死亡[7]。

3 国内外牛球虫病的流行病学调查

牛球虫病在春、夏、秋3个季多发，多雨、潮湿、低洼、阳光不充足、卫生条件差等都容易使牛感染球虫。2岁内的犊牛发病率较高，患病严重，成年牛多呈带虫散播病原的状态。

目前，国内大部分地区都对牛球虫病的流行情况进行了调查，通过形态学特征进行种类鉴定。奶牛感染率最低的地区为呼和浩特，仅为9.54%，且种类较少[8]；而安徽省奶牛的感染率最高，达到了66.34%[9]；新疆维吾尔自治区北疆地区犊牛艾美耳球虫的感染率为35.55%，6月龄以下犊牛感染率高达42.25%[10]。河南省奶牛艾美耳球虫的感染率为37.7%，共检测到11种球虫，其中E.bovis和E.ellipsoidalis的感染比例较高，且6月龄以下的犊牛易感[11]。上海部分牛场奶牛球虫感染率为39%～67%，内蒙古自治区奶牛的感染率为45%，两地区优势虫种均为E.bovis、E.ellipsoidalis和E.zuernii[12]。一般是4周龄开始感染，14周龄感染率最高，以后减少；各地区调查结果显示牛球虫病主要感染犊牛。

国外牛的饲养量很高，因而也存在艾美耳球虫的感染。在奥地利，艾美耳属球虫的感染率高达83.67%，腹泻牛的感染量较非腹泻牛多；共发现了11种艾美耳球虫，所有的农场均出现混合感染，各个省份的患病率也普遍较高[13]。巴西牛球虫的流行病学调查结果显示，1～16月龄的奶牛和1～8月龄的肉牛感染艾美耳球虫的比例较其他年龄段的牛高[14]。印度尼西亚9个省份的调查结果发现，牛球虫病的患病率达到了72.07%，共鉴定出8种艾美耳球虫[15]。巴基斯坦部分地区牛的艾美耳球虫感染情况的调查结果则表明，在雨季和雨季后一段时间球虫的感染率较高，犊牛比成年牛更易感[16]。在管理和饲养条件下，饲养系统、饮水系统、住房系统、地板类型和牛群大小强烈影响了艾美耳球虫在牛中的流行。与槽饲系统、喝自来水动物、开放住房系统和部分胶结的地板类型相比，球虫病在地面饲养系统、喝池塘水动物、封闭住房系统和非胶结地板类型中更为常见。TOMCZUK等[17]对波兰及中东地区牛球虫病的调查发现，E.bovis的流行受宿主年龄(中年动物流行率最高)和管理类型(群体饲养流行率最高)的影响，E.zuernii的流行受宿主年龄(老年动物流行率低)和牧群大小(受感染的个体仅存在于中大型牧群)的影响，而加拿大艾美耳球虫(E.canadensis)的流行受这3种因素的影响。

自KAWAHARA等[18]确定了牛的6种艾美耳球虫的序列后，部分流行病学调查开始基于分子生物学方法进行。LEE等[19]利用显微镜和PCR技术，评估了韩国腹泻牛的粪便样品中艾美耳球虫的流行情况，在形态学鉴定阳性样品中，通过PCR发现对牛有致病性的E.bovis占7.9%、E.zuernii占6.6%、E.auburnensis占2.1%。EKAWASTI等[20]也利用PCR技术对印度尼西亚爪哇岛的高致病性的艾美耳球虫进行了分析鉴定，其中E.bovis感染率最高为10.4%，而柱状艾美耳球虫(E.cylindrica)的感染率仅为0.4%。张学勇等[21]对青海牦牛的样品进行分子鉴定，确定了E.bovis、E.zuernii和E.ellipsoidalis感染犊牛导致腹泻。

4 牛球虫病的症状及诊断

牛球虫病的潜伏期为2～3周。犊牛在感染球虫后出现症状的时间较短，且呈急性经过，病程达10～15 d。患病初期，表现为精神不振、被毛杂乱、食欲不佳、腹泻、排出的血便中常带有黏膜碎片。发病1周后，犊牛体温升高超过40℃、精神沉郁、食欲废绝、反刍停止、前胃迟缓且肠蠕动音增强、机体消瘦，脱水严重、排便里急后重、粪便稀薄且散发恶臭味。发病后期，病牛体温逐渐降低、体质衰弱、排出黑褐色血便、严重贫血，最后多因体液消耗过度而死亡[22]。成年牛在感染球虫后多呈隐性经过，被毛粗乱，生长缓慢，饲料转化率明显降低，排出含大量虫卵的稀粪，部分混杂血液，多为带虫者，一般不引起死亡。

剖检病死牛发现，尸体严重脱水、皮下脂肪消失、可视黏膜苍白、肠道病变明显、有白色或灰白色坏死灶、直肠内容物呈黑褐色、混杂有大量黏膜碎片和血凝块等，肠黏膜肥厚、严重出血，肠系膜淋巴结肿大[23]。

牛球虫病可以根据流行病学资料、临床症状和病理变化作出初步诊断，确诊还需要进行实验室检测。显微镜检查患病牛的新鲜粪便，发现大量圆形或椭圆形的球虫卵囊即可确诊[24]。对于病死牛，用寄生部位的肠黏膜抹片,观察到香蕉型裂殖子和卵囊可确诊感染球虫[25]。

对于感染艾美耳球虫种类的识别，主要通过形态学观察和分子生物学鉴定。形态学观察是对粪便样品中的卵囊进行孢子化，根据不同艾美耳球虫孢子化卵囊的形态特征镜检判断。分子生物学鉴定目前仅能用于6种艾美耳球虫的种类辨别，分别为：E.bovis、E.ellipsoidalis、E.zurnii、E.auburnensis、E.alabamensis和E.cylindrica。

5 防制措施

5.1 预防牛群最好能采取自繁自养、分群管理模式，如需引种，尽量本地引种，因为长途运输会使牛群产生应激，应激会导致牛的免疫力下降，从而容易感染各种病原而发病。另外，场外引种必须从非疫区引进，并且进行严格检疫和隔离，降低引进病原的风险[26]。

高温潮湿的环境有利于球虫生长繁殖，因此需使用药物杀死环境中的球虫，控制其传播；结合疫病流行特点，制定针对性的驱虫措施，合理选择抗球虫药。目前，有一些毒性较低的抗球虫药应用较广，其中盐酸氨丙啉见效快、持续时间长；莫能菌素效果理想，且能促进反刍动物生长发育，提高饲料转化率；地克珠利高效低毒，但停药后持续时间短[27]。应避免长期使用同一种药物，防止耐药性的产生。

一般来说，低感染剂量的摄入球虫通常不会引起疾病，反而对宿主有益，因为它们使宿主产生保护性的免疫，并预防未来的挑战性感染。因此，牛球虫病防制的重点在于将感染压力降低到临界水平，而不是消灭病原体[28]。

5.2 治疗在使用抗球虫药物的基础上结合临床症状对症治疗，提高疗效。用安络血30～50 mg或止血敏0.75～1.0 g肌注，减轻血便症状；30%安乃近20～40 mL肌注用于降温；用生理盐水、碳酸氢钠等溶液静注，补液并调节酸碱平衡[29]。

6 牛艾美耳球虫免疫学方面的研究

宿主在初次感染艾美耳球虫后，机体会产生免疫力，且有严格的种属特异性，这就意味着感染1种艾美耳球虫产生的免疫力不能保护机体免受其余艾美耳球虫的感染。研究发现，艾美耳球虫的感染会导致犊牛IgG1和IgG2抗体水平显着增加，感染过0.7×105卵囊的犊牛对后期1×105卵囊的感染能产生很强的保护性免疫，而相比之下，接触少量卵囊可能无法提供触发免疫反应所需的抗原刺激，不足以预防后续感染[30]。HERMOSILLA等[31]的研究初步表明，犊牛感染E.bovis后能刺激机体产生Th1型的细胞因子，从而产生强烈的免疫应答，但其确切的机制还有待研究。雌二醇-孕酮(EP)治疗健康犊牛会使其CD2+、CD4+、CD8+和单核细胞的水平升高，并且当应用EP时，犊牛感染球虫引起的不良临床症状也大大减轻[32]。

7 牛艾美耳球虫分子生物学的研究

目前，分子生物学研究主要集中在E.bovis的体外培养、分析球虫感染对宿主细胞基因转录的影响和球虫入侵机制及宿主的免疫作用等方面。

利用微阵列方法分析E.bovis感染宿主内皮细胞后，在其不同发育阶段宿主细胞基因转录水平的变化，发现E.bovis感染导致许多宿主细胞基因转录的丰度发生显著变化。球虫的感染阶段与宿主细胞参与不同代谢途径的受调节基因数量之间的相关性表明E.bovis可以利用宿主细胞中的营养物质，与免疫应答相关的调节转录本的数量增加证明了宿主内皮细胞的防御能力[33]。此外，有研究发现E.bovis可充分利用宿主细胞的胆固醇代谢来保证其大量的细胞内生长和复制[34]。

据报道，通过测定流动条件下多形核中性粒细胞(PMN)对受感染内皮细胞层的黏附以及受感染宿主内皮细胞中黏附分子基因的转录来分析E.bovis引起的早期天然免疫反应，结果显示E.bovis感染牛脐静脉内皮细胞(BUVEC)后一方面会引起促炎反应，从而导致黏附分子基因转录上调介导的PMN黏附力增强；另一方面又下调肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的细胞活化[35]。研究证实了PMN参与体外杀死E.bovis的子孢子，即便这些反应可能对体内的原发感染影响较小，但也会参与一连串的事件，涉及特定的免疫反应，在控制E.bovis的感染中有重要意义[35]。 此后，该课题组又建立了以牛结肠上皮细胞(BCEC)为基础的体外培养体系，发现BCEC能够通过其趋化因子10(CXCL10)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因转录的上调对E.bovis第1代裂殖子的感染作出反应，因此可能参与了宿主对E.bovis的先天效应机制[36]。另据报道，形成中性粒细胞胞外陷阱(NETosis)是对抗球虫普遍有效的效应器机制，而E.bovis触发的NETosis形成依赖于巨噬细胞1抗原(CD11b)，细胞外调节蛋白激酶(ERK 1/2)，p38蛋白激酶(p38 MAP kinase)和钙库操作性钙离子通道(SOCE)[37]。

近几年，有学者将以BUVEC为基础的体外培养体系也应用于E.zuernii[38]。从孢子化艾美耳球虫卵囊中能获得大量可存活的子孢子，可用于分子、生化、免疫学和体外试验等研究，LPEZ-OSORIO等[39]提供了一种改进的高效便捷且成本较低的获取反刍动物艾美耳球虫子孢子的方法，该方法首先将孢子化卵囊通过筛子纯化，再进行卵囊壁的降解及酶解，将纯化好的卵囊悬浮于NaHCO3溶液中，置于T75细胞瓶中培养20 h，离心以收集卵囊，随后重悬于0.4%胰酶溶液中孵育2 h，利用3D活细胞三维全息断层扫描显微镜观察子孢子外排过程。此方案可以实现更高的脱囊率，减少了提取子孢子所需的初始卵囊数。

8 结语与展望

近年来，人们对牛球虫病的认识有了很大的提高，对鸡和实验室啮齿动物球虫病的研究可能也极大地促进了牛球虫病的研究进展，但对牛球虫病的深入、系统的研究还很缺乏；大部分研究集中于病原的检测和归属上，而对该病原的致病机制和宿主的防御机制认识较浅。随着新的研究工具不断被开发，牛球虫病的研究将不断深入，有望解决球虫对宿主免疫系统的影响、球虫的分子生物学特性和免疫应答机制等问题，为牛球虫病的防制提供新的更为有效的途径。