Ghrelin与糖尿病肾病的关系

史亚男 胡志娟 王利军 董春霞 冯珍 刘冰

(河北省人民医院，河北 石家庄 050000)

糖尿病(DM)引发的并发症DM性肾病(DN)是DM的重要致死原因之一〔1〕。患者微血管病变最终导致肾衰竭。我国DN患者达到0.6亿，占DM患者的40%以上，尿毒症患者中约17%是由DN所致〔2，3〕。由于DN的病因和发病机制相当复杂，目前认为与糖代谢紊乱、血流动力学改变、细胞因子、遗传易感性等有关。研究发现，在DM大鼠中，Ghrelin在远曲小管及集合管均有表达，且随时间延长，表达强度增加。提示Ghrelin在DN发生的病理生理机制中可能起一定作用，Ghrelin升高可能是一种保护性反应。国内外仅有采用免疫组化的方法，观察Ghrelin在STZ诱导的DM大鼠肾脏表达的报道〔4〕，目前国内尚无Ghrelin在DN方面的研究。本文旨在建立大鼠DN模型，应用氯沙坦进行干预，观察Ghrelin与DN大鼠疾病发生发展的关系。

1 材料与材料

1.1实验动物 54只清洁级健康雄性SD大鼠，体重300～350 g，购自河北医科大学动物实验室，于河北省人民医院医学实验中心饲养。于模型制备前让大鼠适应环境7 d，自由进食，不限饮水，温度22～26℃，湿度40%～70%。

1.2材料 空腹血糖(FPG)、血脂、血肌酐、尿素氮生化试剂盒购于南京建成生物工程研究所；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒购于碧云天生物技术公司；STZ购于Sigma；酶联免疫吸附试验(ELISA)购于联世生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1DM模型的建立〔5〕及分组给药 模型建立 ①大鼠经普通饲料适应性饲养1 w后，选择健康、状态良好、血糖正常的大鼠列入观察。②所有大鼠禁食12 h，给予单次腹腔注射单剂量STZ 65 mg/kg，(STZ临用前溶解于0.1 mol/L、pH4.5的柠檬酸盐缓冲液)，注射STZ 72 h后，尾静脉采血，以血糖高于16.7 mmol/L者，视为DM大鼠造模成功。DN造模成功的标准：尿量>原尿量150%，尿蛋白排泄率>30 mg/(mmol·Cr)。分组及给药：将成模的大鼠随机分为DN模型组(DN组)、DN+氯沙治疗组(氯沙坦组：造模后每日早晨给予默沙东公司生产的氯沙坦30 mg/kg灌胃1次)。氯沙坦组日常给予高脂饮食喂养。另选18只正常大鼠作为对照组，对照组和DN组日常予以等量缓冲液灌胃。

1.3.2Ghrelin测定 各组于给药后第12周末禁食不禁水10 h，以0.33 ml/L 100 g体重腹腔注射10%水合氯醛麻醉动物。心脏取血标本约3 ml。其中1 ml中加入预冷的乙二胺四乙酸(EDTA)1 mg、抑肽酶70 μg混匀，4℃，3 000 r/min离心15 min，取上清-20℃贮存，用于Ghrelin测定；其余直接离心得血清，-20℃贮存，用于FPG、血脂、血肌酐测定。

1.3.3ELISA 将约100 mg肾组织加入100 ml磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中，匀浆取上清，-20℃过夜，反复冻融2次后5 000 r/min离心5 min。测定肿瘤坏死因子(TNF)-6、白细胞介素(IL)-6、IL-1β水平。

1.3.4尿样收集 各组处死前单独放置于代谢笼中，禁食不禁水，收集24 h尿液后，2 000 r/min离心10 min，弃沉渣后分装于EP管中，-80℃保存。

1.4统计学方法 采用SPSS22.0软件行χ2、t检验。

2 结 果

2.13组体重、24 h尿量、尿蛋白比较 与对照组比较，DN组体重显著下降(P<0.05)；与DN组比较，氯沙坦组体重无统计学差异(P>0.05)。与对照组比较，DN组24 h尿量、尿蛋白水平均显著升高(P<0.05)；与DN组比较，氯沙坦组24 h尿量及尿蛋白水平均显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 3组体重、24 h尿量、尿蛋白水平比较

2.23组血糖、血清肌酐、尿素氮水平比较 与对照组比较，DN组FPG、血肌酐、尿素氮水平均显著升高(P<0.05)；与DN组比较，氯沙坦组血肌酐、尿素氮水平均显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 3组血糖、血清肌酐、尿素氮水平比较

2.33组肾组织病理学变化 对照组可见鲍氏囊正常的肾小球，肾小球内未见空泡。DN组可见鲍氏囊皱缩的肾小球，肾小球空泡化，可见炎性浸润。氯沙坦组可见鲍氏囊轮廓缩小的肾小球，肾小球结构受损，空泡数量少。见图1。

图1 3组肾组织病理学变化(HE染色，×400)

2.43组肾组织中炎症因子比较 与对照组比较，DN组TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著升高(P<0.05)；与DN组比较，氯沙坦组TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著降低(P<0.05)。见表3。

2.53组肾组织中纤维化指标水平比较 与对照组比较，DN组转化生长因子(TGF)-β1、纤维连接蛋白(FN)水平均显著升高(P<0.05)；与DN组比较，氯沙坦组TGF-β1、FN水平均显著降低(P<0.05)。见表3。

2.63组血清Ghrelin、核转录因子(NF)-κB水平比较 与对照组比较，DN组Ghrelin水平显著降低，NF-κB水平显著升高(P<0.05)；与DN组比较，氯沙坦组Ghrelin水平显著升高，而NF-κB水平显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 3组肾组织中炎症因子、纤维化指标及血清Ghrelin、NF-κB水平比较

3 讨 论

我国年龄标准化的DM发病率已高达10%〔6〕，DN最终导致患者致残、致死。国内外采用各种药物进行综合治疗，但只能缓解患者肾功能减退〔7〕，研究报道Ghrelin可激活脓毒血症大鼠模型的胆碱能通道，从而抑制促炎因子的表达，减轻胃肠道炎症〔8〕。Ghrelin为生长激素促分泌素受体，有免疫功能〔9〕。研究发现，Ghrelin在关节滑液中表达水平〔10〕和炎症标志物TNF-α、IL-6的表达水平呈负相关。研究证实信号通路NF-κB对于调控炎症介质的表达有重要作用，在NF-κB的经典激活过程中，IκBα被磷酸化、继而降解，进而调控包括TNF-α、IL-6、IL-1β等多种促炎因子的转录〔11〕。研究也发现，脓毒症大鼠NF-κB活性升高，Ghrelin干预后，NF-κB活性下降〔12〕。提示Ghrelin或许通过降低脓毒症大鼠信号通路NF-κB活性而降低促炎因子的表达〔13,14〕。研究表明NF-κB在DN大鼠肾组织中含量高，且其表达水平与肾组织炎症反应及肾小管上皮-间充质转分化相关，因此NF-κB很可能是导致肾脏微炎症和间质纤维化的激活通路〔15〕。

关于Ghrelin对DN肾脏炎症确切机制还有待进一步研究。对DN机制的研究越明确深入，越有利于寻找肾脏保护的有效治疗途径，为以后临床预防和治疗DN肾损伤提供重要的参考依据。