表达人源PD-L1的4T1细胞系的构建

王 迪， 王润杨， 杨俊寒， 张 乐， 胡 翰， 汪 洋， 刘滨磊

(湖北工业大学生物工程与食品学院， 湖北 武汉 430068)

PD-L1又称程序性死亡配体1，是共刺激分子B7家族成员之一，由CD274基因编码。PD-L1分子不仅广泛表达于活化T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞等[1]，在许多肿瘤细胞中也高表达，如肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤细胞等[2-3]。PD-L1与PD-1(程序性死亡受体1)结合传递免疫抑制信号，抑制T、B细胞增殖分化和细胞因子等的产生[4]。PD-1/PD-L1途径在诱导维持外周免疫耐受、自身免疫疾病、移植排斥反应、肿瘤免疫疾病等中发挥关键作用。PD-1/PD-L1免疫疗法在针对晚期或转移性乳腺癌的部分临床试验中显示出了良好的疗效[5]。但是PD-L1的过表达是否与乳腺癌的不良预后密切相关仍存在争议[6]。为更好地了解PD-L1在肿瘤细胞中的作用和机制，本研究构建了稳定表达人源hPD-L1的单克隆细胞株，并将构建成功的4T1-hPD-L1细胞系皮下植入BALB/c小鼠的右侧背部，观察肿瘤生长情况。

1 实验材料

hPD-L1基因片段，金斯瑞生物科技股份有限公司；PBDP转座酶辅助质粒，System Biosciences公司；小鼠乳腺癌4T1细胞，北京协和医院细胞资源中心；细胞培养所用DME/F-12培养基，美国HyClone公司；胎牛血清，四季青；嘌呤霉素，德国Biofroxx公司；抗人源PD-L1鼠单克隆抗体，美国BD公司；Lipofactamine3000转染试剂盒，Thermo Fisher Scientific公司；质粒小提试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司。BALB/c小鼠，湖北省疾病控制中心。

2 实验方法

2.1 4T1细胞嘌呤霉素敏感性实验

收集T-75cm2培养瓶中的4T1细胞，以每孔2×105个细胞接种在12孔板中，于37℃恒温、5% CO2浓度的细胞培养箱中培养。第2 天更换培养基，避光加入不同浓度梯度的嘌呤霉素。连续7 d观察记录细胞存活率，以4 d内杀死孔板中所有细胞的最低嘌呤霉素浓度为最佳筛选浓度[7]。

2.2 质粒提取

hPD-L1基因片段由金斯瑞公司合成。冰上解冻大肠杆菌感受态DH5α，加入2 μL质粒，冰上静置10 min，42℃水浴热激90 s，冰上静置5 min，涂LB-Amp平板，37℃倒置培养过夜。第2 天挑取单菌落，接种在LB液体培养基中(含Amp抗性)，置于37℃摇床200 r/min振荡培养14 h。参照诺唯赞质粒小提试剂盒说明书进行质粒提取。

2.3 细胞转染

转染前1 d，将4T1细胞以2×105个/mL细胞密度接种于12孔板。待细胞汇合度至85%，更换培养基。参照Lipofactamine3000说明书进行实验操作。取两个1.5 mL EP管，A管中加入95 μL DME/F-12培养基，5 μL P3000，20 μL PBDP-hPD-L1质粒和5 μL PBDP转座酶辅助质粒(质粒与辅助质粒质量比为4∶1)；B管中加入125 μL DME/F-12培养基和3.75 μL Lipofactamine3000[8]。A、B管溶液混合，室温孵育10 min，加入细胞孔板中，置于37℃恒温、5% CO2浓度的细胞培养箱中培养。转染48 h后，在倒置荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，加入嘌呤霉素连续筛选7 d，每隔2～3 d更换培养基并补加嘌呤霉素。

2.4 单克隆细胞获取

收集经嘌呤霉素筛选后的细胞，稀释至500个/mL。取96孔板，每孔加入100 μL完全培养基(含10%胎牛血清的DME/F-12培养基)和2 μL细胞悬液，将细胞培养板置于37℃恒温、5% CO2浓度的细胞培养箱中培养。7 d后，在倒置荧光显微镜下观察并记录只有单个细胞团且发绿色荧光的孔。当细胞汇合度达到80%，消化，依次扩大培养至12孔板、6孔板。

2.5 流式细胞术检测4T1-hPD-L1细胞纯度

收集1×106个培养在6孔板中的4T1-hPD-L1细胞，取野生型4T1细胞作为空白对照，加1 mL PBS洗1次，加入5 μL偶联APC荧光染料的抗人源PD-L1鼠单克隆抗体，室温避光孵育25 min。加1 mL PBS洗2次，用BD Accuri C6流式细胞仪对样品进行检测。用FlowJo V10软件分析检测结果。

2.6 4T1-hPD-L1成瘤性实验

从湖北省疾控中心购买3只6周龄雌性的BALB/c小鼠。将4T1-hPD-L1细胞稀释至1×107个/mL，在每只BALB/c小鼠右侧背部皮下注射1×106个4T1-hPD-L1细胞(100 μL)[9]。7 d后观察成瘤性，连续观察40 d。用游标卡尺测量小鼠肿瘤体积大小，计算公式为：V=1/2×长径×短径×短径。

3 实验结果

3.1 PBDP-hPD-L1质粒构建

PBDP-hPD-L1转座子载体质粒序列全长8102 bp。人源hPD-L1序列在NCBI上查找获得(Gene ID: 29126)。hPD-L1基因由CMV强启动子启动转录。CopGFP和PuroR基因由T2A肽连接。连接后的序列由EF-1α核心启动子启动转录(5’LTR包含增强子等调控原件)，二者共享同一个polyA信号，由此构建PBDP-hPD-L1-GFP质粒。

3.2 4T1细胞转染

PBDP-hPD-L1质粒和PBDP转座酶辅助质粒共同转染4T1细胞，转染48 h后，在倒置荧光显微镜下能观察到细胞发绿色荧光。

图1 PBDP-hPD-L1质粒图谱 图 2 PBDP-hPD-L1转染4T1 48h

3.3 4T1-hPD-L1细胞挑取单克隆、扩培

将4T1-hPD-L1细胞稀释至500个/mL，在96孔板中培养7 d后，可在倒置荧光显微镜下观察到单个且带有绿色荧光的细胞团。将细胞扩培(图3)。

图3 4T1-hPD-L1单克隆细胞扩培

3.4 流式细胞术检测4T1-hPD-L1单克隆细胞

流式检测对照组4T1细胞和实验组4T1-hPD-L1细胞中GFP和PD-L1的表达量，结果显示实验组细胞双阳性率为97.0%(图4)。

图4 4T1-hPD-L1单克隆细胞GFP和PD-L1表达

3.5 4T1-hPD-L1肿瘤模型建立

将4T1-hPD-L1细胞皮下植入BALB /c小鼠右侧背部，3只小鼠背部均长出瘤块，14 d后体积生长至100 mm3，成瘤率达100%。绘制肿瘤生长曲线(图5)，肿瘤体积随着时间增长而增加。

图5 BALB/c皮下肿瘤生长曲线

4 结束语

PD-L1通过与PD-1结合抑制T细胞功能，从而使肿瘤发生免疫逃逸，阻断PD-1/PD-L1通路成为目前免疫治疗的研究热点[10]。目前国内外已有3种PD-L1单克隆抗体药物被批准上市，可用于治疗非小细胞肺癌和尿路上皮癌等癌症。但PD-L1抗体药物并非对所有患者有效，原因可能和原发性耐药、继发性耐药、肿瘤突变负荷、患者体内PD-L1表达量不同等相关[11]。

转座子是一段可插入宿主基因组内并改变位置的DNA序列。通过将外源基因引入到特定的细胞、组织中，转座子系统广泛应用于基因敲除、诱导突变、转基因动物等实验研究中[12]。通过转座子系统构建PD-L1高表达的肿瘤细胞，可为研究PD-L1抗体药物提供参考。

本实验采用脂质体将PBDP-hPD-L1质粒和PBDP转座酶辅助质粒转入小鼠乳腺癌4T1细胞中，在倒置荧光显微镜下观察转染效率；经过嘌呤霉素筛选、有限稀释法获得单克隆细胞系；通过流式细胞术检测细胞中GFP和PD-L1双阳性率为97.0%，成功构建稳定表达GFP和人源hPD-L1的鼠乳腺癌4T1-hPD-L1细胞系。将构建成功的细胞系皮下植入BALB/c小鼠背部，建立乳腺癌皮下肿瘤模型。此模型的成功构建为研究PD-L1抗体药物提供了稳定可靠的动物模型，为进一步研究PD-L1分子的功能提供参考。