紫杉醇联合百合皂苷对口腔鳞癌细胞增殖和迁移能力影响的研究*

李 君,赵蔚林,曹 强

(湘潭医卫职业技术学院，湖南 湘潭 411102)

随着工业化的不断发展和人们生活节奏的加快，以及生活方式的不断改变，精神心理、免疫因素的不断变化，恶性肿瘤的发病率和病死率每年均呈现高速增长态势。湖南部分地区人群有吃槟榔的习惯，使该地区成为口腔癌的高发地区[1-2]。口腔癌是发生在口腔黏膜上皮的恶性肿瘤，以鳞状细胞癌为主。对于口腔癌的治疗，早期主要采取以外科手术治疗为主的综合治疗，手术治疗可以切除原发病灶，并对颈部淋巴结进行相应治疗，从而提高患者的生存质量，延长患者的生存时间。但对于远处转移者或需要预防口腔癌复发者，化学药物的治疗也是一种重要手段[3-4]。百合皂苷是从中药百合中提取的有效成分，现代医学认为百合皂苷具有抗癌、止咳平喘、镇静催眠、降血糖、抗氧化等功效[5-6]；紫杉醇是目前发现的天然抗癌药物，已经广泛用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌、食管癌及头颈部肿瘤的治疗[7]。本研究以人口腔鳞癌细胞作为研究对象，探讨百合皂苷联合紫杉醇对人口腔鳞癌细胞增殖和迁移的影响，将为临床治疗口腔鳞癌提供坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器 MCO-18型二氧化碳细胞培养箱(济南卓隆生物科技有限公司)，HD-650型细胞培养超净工作台(郑州安晨科学仪器有限公司)，MDF-C8V1型-80 ℃超低温保存箱(浙江和仪器有限公司)，CP-90XA型超速离心机(北京昊诺斯科技有限公司)，DR-200B型酶联免疫检测仪(济南双秀生物技术有限公司)，HBS-1096型高压灭菌锅(深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司)，HH-600型电热恒温水箱(上海沉汇仪器有限公司)。

1.1.2实验材料 人类口腔癌细胞系CAL27购自武汉大学附属细胞库。

1.1.3试剂 DMEM高糖培养液购自上海语纯生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)购自武汉尚恩生物科技有限公司；胰蛋白酶消化液购自浙江羽翔生物科技有限公司；青霉素-链霉素双抗溶液购自浙江联硕生物科技有限公司；6、96孔板购自上海西唐生物科技有限公司；细胞增殖实验(MTT)试剂购自北京百奥莱博科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购自上海研谨生物科技有限公司；Caspase-3抗体购自北京华夏远洋科技有限公司；细胞裂解液购自广州左克生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1人类口腔鳞癌细胞CAL27细胞的培养 复苏CAL27细胞，将DMEM高糖培养液与青霉素-链霉素双抗溶液通过1∶100的比例进行配置，将细胞从液氮保存灌中取出，将细胞冻存管放入电热恒温水箱，以37 ℃的温度进行解冻。用75%的乙醇喷洒及擦拭细胞培养超净实验台，然后放入细胞培养超净台中，将解冻的CAL27细胞移进细胞培养瓶中，并向培养瓶中加入配置好的培养液，混合均匀，放入二氧化碳细胞培养箱中，经过48 h的培养后将培养瓶从二氧化碳细胞培养箱中取出，放入细胞培养超净实验台中，倒去培养液；使用PBS冲洗，倒去PBS后，向培养瓶中加入适量胰蛋白酶消化液，充分消化后，弃去胰蛋白酶消化液，向培养瓶中加入配置好的培养液，反复吹打，将细胞悬液接种于新的培养瓶中，加入培养液，放入二氧化碳细胞培养箱中培养。

1.2.2MTT 使用胰蛋白酶消化液消化处理数期生长的CAL27细胞，离心后收集制成细胞悬液，调整其浓度至5×104mL-1，接种于96孔板，放入二氧化碳细胞培养箱中培养，依次加入百合皂苷、紫杉醇联合制剂(10 、20 、40 、80 、160 μg/mL)，每个浓度设置5个复孔，同时设置实验对照孔和空白孔。分别在培养到24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h后终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO溶液，置于摇床上振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪光密度(OD) 490 nm处测量各孔的吸光度(A)值。通过检测实验对照组、空白组的A值，计算口腔癌细胞增殖抑制率。

1.2.3细胞划痕实验(Wound Healing) 将直尺和Marker笔在细胞培养超净实验台内用紫外线照射30 min，然后使用Marker笔在6孔板背后画横线，在孔中加入8×105个细胞，加入DMEM高糖培养液，培养24 h，使其形成单层细胞，用10 μL移液器枪头在单层细胞上一字划痕，用PBS清洗3次，加入百合皂苷、紫杉醇联合制剂作为加药组(阳性对照)，同时设置未加药组(阴性对照)和空白对照组进行比对，放入二氧化碳培养箱中进行培养，24 h后换1次培养基，继续培养24 h，吸去培养液，用PBS清洗3次，放置于倒置荧光显微镜下观察并拍照，观察加药组、未加药组及空白对照组划痕愈合现象。

1.2.4Western blotting实验 使用百合皂苷及紫杉醇的联合制剂处理CAL27细胞(联合用药组)，同时设置未处理CAL27细胞组(未加药组)，加药后放入二氧化碳培养箱培养48 h，之后倒掉培养液，PBS缓冲液清洗3次，加入细胞裂解液，轻轻摇动3 min，使用刮子将培养瓶上的细胞刮下，将细胞悬液收集于离心管中，边摇动边裂解10 min，然后放入离心机(12 000 r/min)离心10 min，将上清液移入离心管保存备用。采用Bradford蛋白浓度测定法，使用不同体积的牛血清白蛋白(BSA)、纯水及900 μL的考马斯亮蓝G250，配制成浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的BSA溶液，轻微振荡5 min后加入孔板中，根据A值计算蛋白浓度。将配制好的分离胶加入玻璃板中，下层胶凝固之后，加入浓缩胶，插入齿梳，浓缩胶凝固后拔出齿梳，固定在电泳槽上，并加入600 mL的电泳缓冲液，上样并开始电泳，电泳结束后，取出分离胶进行转膜，转膜结构顺序如下：黑色面-海绵-三层滤纸-凝胶-聚偏二氟乙烯膜-三层滤纸-海绵-白色面，转膜结束后，封闭液封闭2 h，4 ℃条件下，一抗孵育过夜，TBST溶液清洗2次，室温下二抗孵育2 h，TBST溶液洗膜，凝胶成像系统显影，计算对应条带灰度值[8-9]。

1.3统计学处理 所有数据均使用SPSS21.0统计软件进行处理分析，组间差异采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1百合皂苷、紫杉醇联合用药对CAL27细胞增殖能力的影响 CAL27细胞在由低浓度到高浓度的百合皂苷、紫杉醇联合用药处理24、48、72 h后，口腔鳞癌CAL27细胞增殖能力随百合皂苷、紫杉醇联合制剂的浓度不断升高而逐渐减弱，实验对照组与空白组CAL27细胞增殖能力比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 百合皂苷、紫杉醇不同浓度联合用药对CAL27细胞增殖能力的影响

2.2百合皂苷、紫杉醇联合用药对CAL27细胞迁移能力的影响 空白对照组单层细胞上划出一道痕，加药组由于加入药物的作用，CAL27细胞迁移受到抑制，未加药组的细胞仍然保持原有的迁移能力，一段时间后，通过细胞迁移能够将划痕覆盖。加药组与空白对照组细胞愈合率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

A.空白对照组；B.加药组；C.未加药组。图2百合皂苷、紫杉醇联合用药对CAL27细胞迁移能力的影响(200×)

2.3百合皂苷、紫杉醇联合用药对CAL27细胞中Caspase-3蛋白表达情况的影响 联合用药组CAL27细胞中Caspase-3蛋白的表达明显高于未加药组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

A.两组CAL27细胞中Caspase-3蛋白表达Western blotting图；B.两组CAL27细胞中Caspase-3蛋白表达比较。图3 百合皂苷、紫杉醇联合用药对CAL27细胞中Caspase-3蛋白表达情况的影响

3 讨 论

本研究中，MTT结果提示，百合皂苷、紫杉醇联合制剂对口腔鳞癌细胞CAL27细胞增殖具有抑制作用。细胞划痕实验结果提示，百合皂苷、紫杉醇联合制剂对口腔鳞癌CAL27细胞迁移具有抑制作用。通过Western blotting方法，测得百合皂苷、紫杉醇联合处理CAL27细胞组(联合用药组)中促凋亡相关蛋白Caspase-3的表达明显高于未加药组。结果提示，百合皂苷、紫杉醇联合用药可能通过诱导口腔鳞癌CAL27细胞发生凋亡的方式抑制其增殖迁移的。

口腔鳞癌作为近几年发展较快的恶性肿瘤，也同样存在相关癌基因的活化，抑癌基因的失活以及信号通路的活化，有研究表明，抑癌基因P53的突变广泛参与口腔鳞癌的发生、发展，作为广泛参与多种肿瘤发生、发展的JAK-STAT信号通路在口腔鳞癌中也处于过度活化状态；还有研究表明，口腔癌细胞可以通过活化Wnt信号通路来抑制细胞凋亡机制的发生，进而促进肿瘤的发生、发展、增殖及转移[10-15]。当细胞面临的内环境发生改变时，细胞通过自我分解自身蛋白质或者降解衰老、病变的细胞质内的成分，能够更好地去适应环境，更容易生存，对于恶性肿瘤来说，自噬现象显得尤为重要。有研究表明，通过对恶性肿瘤细胞进行体外耐药实验证实，发生耐药的肿瘤细胞更容易形成自噬体，适应抗肿瘤微环境[15]。百合皂苷、紫杉醇联合用药是否通过细胞凋亡或者细胞自噬机制来抑制CAL27细胞增殖迁移，还需要进一步做基因分子研究，也将成为下一个研究方向和重点。