蚌埠及周边地区血脂异常患者SLCO1B1与APOE基因多态性分析及临床意义*

孙思雨，李 楠，丁海虎

(1.蚌埠医学院第二附属医院药剂科，安徽 蚌埠 233040；2.蚌埠医学院基础医学部，安徽 蚌埠 233000)

作为羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂的他汀类药物(statins)，是临床降脂的首选药物，也是预防心脑血管疾病的重要药物之一[1]。然而，他汀类药物的使用存在较大个体差异，部分患者会出现神经毒性、肝毒性、肌肉毒性、肝毒性及胃肠道反应等不良反应[2]，因此为临床医生选择个体化用药和预后评估等方面带来了很大的困扰。研究发现，他汀类药物不良反应与遗传因素相关，尤其与有机阴离子转运多肽(OATP1B1)编码基因SLCO1B1及载脂蛋白E(APOE)基因的单核苷酸多态性(SNP)密切相关，SLCO1B1与APOE的不同基因型对药物的疗效及不良反应差异较大[3]。进行SLCO1B1与APOE基因检测能够帮助临床医生对患者实施个体化用药指导，因此具有重要的诊断意义，并能提示他汀类药物不良反应发生风险。本研究对蚌埠医学院第二附属医院收治的血脂异常患者进行SLCO1B1和APOE基因多态性位点分析，采用聚合酶链反应(PCR)-荧光探针法，以分子水平分析蚌埠及周边地区SLCO1B1和APOE基因多态性分布，可以防止心脑血管疾病的发生，为个体化治疗奠定基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年7—12月在蚌埠医学院第二附属医院就诊的血脂异常患者为研究对象。入组标准：(1)年龄大于18岁患者；(2)患者血脂指标：血清总胆固醇(TC)≥5.2 mmol/L，即大于200 mg/dL；或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)≥3.4 mmol/L，即大于130 mg/dL；或高密度脂蛋白胆固醇小于1.0 mmol/L，即小于40 mg/dL；或甘油三酯大于或等于1.7 mmol/L，即大于200 mg/dL。(3)经蚌埠医学院第二附属医院医学伦理专业委员会审查通过，患者签署知情同意书。(4)长期服用他汀类药物的患者。排除标准：合并有严重心脑血管疾病和严重肝肾疾病的患者。经筛选后共选取符合要求患者1 530例，采用PCR-探针法对SLCO1B1和 APOE基因进行多态性位点分析。患者年龄30～95岁，其中男1 002例，女528例，平均年龄(67±16)岁。

1.2方法

1.2.1仪器和试剂 SLCO1B1和APOE基因多态性检测试剂盒(PCR-荧光探针法)购自武汉友芝友医疗科技有限公司；核酸提取纯化试剂盒购自苏州旷远生物分子技术有限公司；全自动医用PCR分析系统(型号：SLAN-48P)购自上海宏石医疗科技公司；全自动核酸提取仪(型号：NP968-C)购自西安天隆科技公司；超净工作台(型号：SW-CJ-1D)购自上海苏净公司；高速离心机(型号：TGL-16G)购自江苏新康医疗公司。

1.2.2核酸提取 收集1～2 mL紫色乙二胺四乙酸抗凝全血(无须空腹，可正常饮食，2～4 ℃冰箱保存，72 h内处理)。按照核酸提取说明书进行操作，提取核酸：在96孔预装板的第1列和第7列先加入核酸释放剂60 μL及蛋白酶K 16 μL,之后在第1列和第7列加入全血样本200 μL，选择全自动核酸提取仪按照提取操作程序进行核酸提取，运行时间为48 min。运行结束后，相应第6列和第12列为对应标本DNA，用100 μL移液枪吸取75 μL核酸至1.5 mL EP管中。所提取的核酸用微量紫外分光光度计进行检测，核酸 A260/ A280在1.8～2.0，A260/A230>2。推荐定量浓度稀释为5～15 ng/μL,要求核酸原液-20 ℃保存。

1.2.3PCR扩增 SLCO1B1和APOE反应体系：根据标本数准备好八联管，先加入提取好的核酸2.4～2.6 μL，之后加入ApoE2、ApoE4、SLCO1B1*1b、SLCO1B1*5反应液各21 μL，每个标本加4个孔，同时做弱阳性对照和空白对照，盖上PCR反管盖，同时做好标记，排除管内多余气泡并进行涡旋混匀。先打开全自动医用PCR分析系统并检查是否正常运行，扩增程序设置为40个循环：37 ℃ 10 min、95 ℃ 5 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s。将数据采集定在60 ℃，荧光信号收集为VIC通道(SLCO1B1*1b388G、SLCO1B1*5521C、ApoE2526T和ApoE4 388C)、FAM通道(SLCO1B1*1b388A、SLCO1B1*5521T、 ApoE2526 、ApoE4388T)和ROX通道(内标基因)。

1.2.4结果判断 (1)样本有效性的判定：内标基因(ROX通道)的Ct<38，扩增曲线有明显指数增长期。(2)样本基因多态性判定：相应通道的Ct<38，扩增曲线有明显指数增长期，则该通道代表的基因型为阳性。若Ct≥38或无Ct值，则该通道代表的基因型为阴性。(3)试剂盒有效性判定：①弱阳性对照，FAM、VIC、ROX通道Ct≤32，扩增曲线有明显指数增长期；②空白对照，FAM、VIC、ROX通道扩增曲线为轻微斜线或直线，或无扩增曲线，无明显指数增长期，Ct≥38或无Ct值。(4)基因类型判定：若仅ROX通道Ct<38，FAM通道无Ct值或Ct≥38，则判断为纯和突变型；若仅 FAM通道Ct<38，ROX通道无Ct 值或Ct≥38，则判断为纯和野生型；若ROX通道和FAM通道的Ct值均小于38，则判断为杂合型。

1.3统计学处理 采用SPSS22.0统计软件对数据进行分析，计数资料以例数表示，进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，然后分别计算基因型及基因频率。基因型及等位基因频率与其他地区已报道数据进行比较，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1蚌埠及周边地区患者APOE基因多态性分布 他汀类用药与APOE基因388T>C、526C>T 2个位点有关，APOE2和APOE4是APOE的检测基点，可形成6种基因型及其所占比例分别为 0.52%(E2/E2)、14.12%(E2/E3)、1.96%(E2/E4)、67.12%(E3/E3)、15.10%(E3/E4)、1.18%(E4/E4)。其中APOE的疗效正常基因型(E2/E4 、E3/E3)组合最多，占比为69.08%，见表1。

表1 蚌埠及周边地区患者SLCO1B1和APOE基因多态性分布情况(n=1 530)

2.2蚌埠及周边地区患者SLCO1B1基因多态性分布 他汀类用药与SLCO1B1基因388A>G、521T>C两个位点多态性有关，SLCO1B1*1b和SLCO1B1*5是SLCO1B1的检测基点，可形成9种基因型，所占比例分别为4.90%(*1a/*1a)、30.13%(*1a/*1b)、36.60%(*1b/*1b)、0.59%(*1a/*5)、8.24%(*1a/*15)、17.32%(*1b/*15)、 0.26%(*5/*5)、 0.13%(*5/*15)、1.83%(*15/*15)。正常肌病风险患者占比为71.65%，中度肌病风险患者占比为26.15%，高度肌病风险患者占比2.22%，见表1。根据服用的药物剂量与肌病的风险发生横纹肌溶解症可见，正常肌病风险基因型(*1a/*1a、*1a/*1b、*1b/*1b)组合最多，高度肌病风险患者肝脏摄取药物能力较差，发生横纹肌溶解症，建议使用较低剂量他汀类药物；对于中度肌病风险患者，建议使用中等剂量他汀类药物。

2.3不同性别患者SLCO1B1基因多态性分布差异 男性患者的SLCO1B1各基因型所占比例分别为4.79%(*1a/*1a)、29.54%(*1a/*1b)、36.13%(*1b/*1b)、0.80%(*1a/*5)、8.68%(*1a/*15)、18.16%(*1b/*15)、0.30%(*5/*5)、0.20%(*5/*15)、1.40%(*15/*15)。正常肌病风险基因型占比为70.46%，占比最大；中度肌病风险占比为27.64%；高度肌病风险占比为1.90%。女性患者的SLCO1B1各基因型所占比例分别为5.11%(*1a/*1a)、30.87%(*1a/*1b)、37.88%(*1b/*1b)、0.19%(*1a/*5)、7.39%(*1a/*15)、15.72%(*1b/*15)、0.19%(*5/*5)、0(*5/*15)、2.65%(*15/*15)。正常肌病风险基因型占比为73.86%，占比最重；中度肌病风险占比为23.30%；高度肌病风险占比为2.84%。男女患者SLCO1B1各基因型占比比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见图1。

图1 不同性别患者SLCO1B1基因多态性分布结果

2.4不同性别患者APOE基因多态性分布差异 男性患者APOE的各基因型所占比例分别为0.60%(E2/E2)、14.07%(E2/E3)、 2.10%(E2/E4)、66.96%(E3/E3)、15.07%(E3/E4)、1.20%(E4/E4)。疗效正常基因型占比为69.06%，占比最大；疗效较好基因型占比为14.67%；疗效较差基因型占比为16.27%。女性患者APOE的各基因型所占比例分别为0.38%(E2/E2)、14.58%(E2/E3)、1.70%(E2/E4)、67.05%(E3/E3)、15.15%(E3/E4)、1.14%(E4/E4)。疗效正常基因型占比为68.75%，占比最大；疗效较好基因型占比为14.96%；疗效较差基因型占比为16.29%。男女患者APOE各基因型占比比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 不同性别患者SLCO1B1基因多态性分布结果

2.5蚌埠及周边地区患者APOE基因型分布及等位基因频率分布 1 530例患者中，APOE基因的388T>C位点检测出野生型(TT)1 251例，纯合突变型(CC)18例，杂合突变型(TC)261例，等位基因发生突变率为9.71%；APOE的526C>T位点共检测出野生型(CC)1 276例，纯合突变型(TT)8例，杂合突变型(CT)246例，等位基因发生突变率为8.56%。APOE的等位基因分布频率与基因型见表2。

表2 蚌埠及周边地区患者APOE基因型和等位基因分布频率

2.6蚌埠及周边地区患者SLCO1B1基因型分布及等位基因频率分布 1 530例患者中，SLCO1B1基因的388A>G位点检测出野生型(AA)88例，纯合突变型(GG)853例，杂合突变型(AG)589例，等位基因发生突变率为75.00%；基因SLCO1B1的521T>C位点检测出野生型(TT)1 096例，纯合突变型(CC)34例，杂合突变型(TC)400例，等位基因突变发生率为15.29%。SLCO1B1的等位基因分布频率与基因型见表3。

表3 蚌埠及周边地区患者SLCO1B1基因型和等位基因分布频率

采用χ2检验，将本研究中基因型及等位基因频率与其他地区已报道数据进行比较，论证SLCO1B1及APOE基因的上述多态性位点突变频率观察值符合Hardy-wenberg遗传平衡(P>0.05)，具有群体代表性。

3 讨 论

引起心脑血管疾病的主要原因是血脂异常，在我国人群中，因TC水平增高所导致的缺血性脑卒中事件发生率约为冠心病2倍以上，他汀类药物就成为临床使用最为广泛的降脂药[4]，循证医学证据显示，他汀类药物降低LDL-C有明显的个体差异(10%～70%)[5]，会引起相关不良反应，如肌肉毒性、肝毒性、糖尿病和认知功能改变等，因此基因多态性已成为影响他汀类药物降脂效果及不良反应发生风险的重要因素之一。

APOE基因存在于人体第19号染色体长臂13区上[6]。机体脂质代谢的调节因子是APOE基因的388T>C、526C>T，是影响他汀类降脂疗效的主要因素，也是动脉粥样硬化性心脑血管病和高脂血症的候选易感基因。APOE基因形成APOE2(388T-526T)、APOE3(388T-526C)、APOE4(388C-526C)3种单倍体和6种表型[7]。其中APOE3(388T-526C)为野生型，对机体正常生理功能发挥起重要作用。APOE2(388T-526T)为突变型，携带者血浆TC、LDL-C水平低于APOE3(388T-526C)型患者，他汀类药物降脂效果相对其他2型最好。APOE4(388C-526C)为突变型，与阿尔兹海默病(AD)、心脑血管病、冠心病、抑郁症的高发性相关[8]，降脂疗效往往不佳或无疗效，TC、LDL-C水平均远高于APOE3型。

人类的SLCO1B1基因存在于12号染色体上，SLCO1B1基因2种常见的单核苷酸多态性是388A>G、521T>C[9]。SLCO1B1基因可形成SLCO1B1*1a(388A-521T)、SLCO1B1*1b(388G-521T)、SLCO1B1*5(388A-521C)、SLCO1B1*15(388G-521C)4种单倍体和9种表型[10]。有机阴离子转运多肽OATP1B1参与多种药物的转运，在他汀类药物代谢中将血液中的药物转移至肝脏中，从而直接发挥药效，是具有基因多态性的跨膜转运蛋白[11]，OATP1B1转运蛋白活力减弱是由突变型SLCO1B1基因引起，会增加肝毒性，导致肝脏摄取药物能力降低，造成他汀类药物血药浓度上升，加重横纹肌溶解症或肌病的风险。有研究表明，携带有*5位点与他汀性肌病的风险显著相关，他汀类药物相关肌病的发生为剂量依赖性，目前临床上已有相关病例报道携带SLCO1B1* 5等位基因是发生横纹肌溶解症的主要原因[12-13]。

蚌埠及周边地区患者中APOE基因的E3/E3型1 027例，占比最大，为67.12%，表明他汀治疗疗效正常；老年痴呆、冠心病、脑梗死风险正常。SLCO1B1基因的*1a/*1b和*1b/*1b共1 021例，占比最大，为66.73%，则可以考虑使用较大剂量他汀。另外，APOE基因和SLCO1B1基因的各表型占比在男女患者之间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；不同性别的APOE与 SLCO1B1 基因型分布符合人群总体分布趋势。

蚌埠及周边地区人群中APOE的E3/E4和E4/E4基因型患者共246例，占比为16.08%；从降脂效果看，他汀类药物疗效较差，有增加冠心病、急性心肌梗死、脑梗死、老年痴呆风险。研究发现：携带1个E4基因患者的AD发病率为47%，而携带2个E4基因患者的AD发病率高达91%，并且，E4基因携带者的发病时间较非携带者提早10～20年[14]。所以，有AD家族史或记忆力已经明显衰退的人群需进行APOE基因多态性检测，因此要尽早干预高风险人群以延缓AD的发生，能更好地指导患者合理化用药和健康生活。SLCO1B1基因的高度肌病风险患者共31例，占比为2.03%，此类患者需要注意药物使用剂量，使用阿托伐他汀降脂效果更好[15]。因此应当重点关注心脑血管患者服用他汀类药物后的反应，筛查APOE风险类及SLCO1B1高度风险基因型不仅可以更好地指导临床医生用药，还可以让患者避免不良反应和达到药物治疗的最大疗效。

总之，SLCO1B1和APOE基因检测能帮助临床更合理地选择药物和剂量，制定个体化的降脂方案，最终使患者受益。