水培蔬菜营养液微生物变化对蔬菜微生物污染风险的影响

宋春宏,顾文佳,葛 宇

(上海市质量监督检验技术研究院,上海 200233)

新鲜蔬菜富含维生素、纤维素、矿物质和其他营养元素,是人们膳食中不可缺少的组成部分[1-2],人类身体所需的维生素C和维生素A大部分来自于蔬菜[3]。许多研究表明,经常规律性地进食蔬菜可以减少癌症、心血管疾病和肥胖症的发病风险[4-8]。无土栽培是现代农业中的高新技术,近年来,营养液栽培的蔬菜面积在我国不断增加,利用营养液代替土壤直接向植物根系提供生长发育所必需的营养元素的栽培方式,具有产量高、品质好、病虫害轻、不受土壤资源限制、易于工业化生产的优点[9]。

营养液是无土栽培中植物生长的主要营养来源,因此营养液的日常管理是无土栽培管理的核心环节[10]。由于长期循环使用,营养液会滋生大量的微生物,使用寿命缩短,增加生产成本。目前,国内外关于营养液废液的处理方式包括循环重复利用和不循环排出方式。营养液废液循环重复利用是指已经使用过的营养液废液经消毒过滤和营养复配等一系列措施,重新回流到原栽培系统循环中再被植物吸收利用,该方式已被欧盟等发达国家广泛应用[11]。不循环利用是由于受到技术和成本等因素限制只能将利用一次后的废液直接排入环境,这种方式造成了大量未被植物吸收利用的氮、磷、钾、NO2-3和其他化学物质的浪费,同时也会造成河流等水体的富营养化问题,对地表和地下水造成污染。未经处理的营养液废液二次利用时容易造成病虫害在栽培体系中广泛传播,会造成不可估量的损失。因此,科学的营养液废液循环利用成为目前无土栽培研究中的一个热点问题[12-15]。

目前,臭氧、紫外线已广泛应用于营养液的杀菌消毒,具有低毒、无残留、环保的特点,但对其在无土栽培过程中微生物变化影响的研究较少。本试验在水培菠菜培育至成熟的过程中,对其营养液供液端和回液端的菌落总数、大肠菌群等指示菌数据进行跟踪和对比,并对这一过程中营养液及成熟蔬菜的菜叶和菜根所含的菌落进行初步鉴定,以期为后续水培蔬菜微生物风险的评估奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 水培菠菜

菠菜品种‘绿冠三号’由上海绿立方农业发展有限公司提供。

1.1.2 培养基与仪器

平板计数琼脂培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂、煌绿乳糖胆盐肉汤、胰蛋白胨大豆琼脂培养基、三糖铁琼脂、李斯特菌选择性添加剂琼脂、李斯特氏菌显色培养基、改良EC肉汤培养基、改良山梨醇麦康凯琼脂、大肠埃希氏菌O157显色培养基、尿素琼脂(以上培养基和试剂均由北京陆桥技术股份有限公司提供)、缓冲蛋白胨水、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、四硫磺酸钠煌绿、亚硫酸铋琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂、李氏菌增菌肉汤(以上培养基和试剂均由无锡赛微生物技术有限公司提供)、BP琼脂平板(广东环凯微生物科技有限公司)。

SMI12生化培养箱(美国Shellab公司),均质机(法国Interscience公司),AUTOF MS2000e MALDITOF MS(郑州安图生物工程股份有限公司),全自动细菌鉴定药敏分析系统(法国生物梅里埃公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 菠菜生长过程中营养液和蔬菜的微生物监测

将菠菜小苗在基质中培植一周后定植到栽培床上,根据外界气候与作物特点,通过备风机、湿帘、天窗等环境管控设施对棚内温湿度及光照环境进行控制,以维持相对稳定的最佳生长环境条件。对于营养液,使用紫外强度100 μW∕cm2的紫外线对混入施肥机之前的水源进行消毒(每日18:00至次日5:00每小时开启20 min);在回液端通过滤棉先把营养液里的杂质过滤掉,再通过4—5 mg∕L的臭氧对回流到封闭水箱的营养液进行消毒(每日18:00至次日5:00每小时开启20 min),之后营养液循环到供液端,以维持菠菜生长环境的相对洁净。

分别于菠菜移栽到栽培床后的1—7周每周对供液端和回液端的营养液进行无菌采样(用无菌袋直接接取100 mL营养液,封好无菌袋,防止污染),对营养液进行菌落总数和大肠菌群计数,并于培育的第1周和第7周对营养液和水培菠菜的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7∕NM等致病菌进行检测。菌落总数检测按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[16],大肠菌群检测按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠菌群计数》[17],沙门氏菌检测按照GB 4789.4—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》[18],金黄色葡萄球菌检测按照GB 4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》[19],单核细胞增生李斯特氏菌检测按照GB 4789.30—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》[20],大肠埃希氏菌O157:H7∕NM检测按照GB 4789.36—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7∕NM检验》[21]。

1.2.2 营养液和成品蔬菜中菌相鉴定

将第7周供液端营养液、回液端营养液稀释至适宜浓度,涂布至平板计数琼脂培养基平板上;将成品蔬菜的菜根和菜叶分别均质后稀释至适宜浓度,涂布至平板计数琼脂培养基平板上。将上述涂布平板置于36℃培养箱培养48 h,从供液端营养液平板、回液端营养液平板、菜根平板、菜叶平板上分别随机挑取不同形态的菌落,接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基上,36℃培养24 h。用1 μL无菌接种环蘸取少量菌落直接涂抹于飞行质谱靶板样本孔位上,取1 μL 70%甲酸涂敷于样本孔位上,彻底干燥后再滴加1 μL α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)基质液,室温干燥后,进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDITOF MS)鉴定[22]。对鉴定结果9.0(种水平置信)以下的菌落,辅助以全自动细菌鉴定药敏分析系统进行鉴定。

1.3 数据分析

1.3.1 七周内营养液中菌落总数和大肠菌群的变化

养殖户反映患病牛发病较为突然，发病初期表现为精神萎靡不振，鼻镜干燥，采食量下降，随着病情的发展，患病牛食欲废绝，反刍减少，直至停止，从口腔中分泌出粘稠的唾液，存在明显的酸臭味。牛会出现间歇性鼓气，自主收缩能力减弱，瘤胃蠕动能力减弱，用手触摸瘤胃，内部充满粘腻感、呈粥状的内容物，触诊瘤胃内容物松软，患病牛胃部存在疼痛感，用手轻轻按压瘤胃存在指痕。患病牛排便量逐渐减少，粪便干硬呈现深褐色，排出的粪便呈现球状，有时在粪便表面附着大量粘液。

使用线性回归法对营养液中菌落总数和大肠菌群的变化进行统计学分析,观察其变化是否有统计学意义。分别将菌落总数(logCFU∕mL)∕大肠菌群(logCFU∕mL)与各个时间点拟合直线,进行线性回归分析,通过t检验法进行判断。

1.3.2 供液端和回液端中菌落总数和大肠菌群的变化

采用独立样本studentt检验比较每个时间点两组间菌落总数∕大肠菌群数的差异是否有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 菠菜生长过程中营养液菌落总数、大肠菌群的动态变化

由图1可以看出,无论是供液端还是回液端,其营养液在菠菜成熟的7周过程中菌落总数始终保持稳定(P=0.862,P=0.802);从图2可以看出,大肠菌群数值第1周到第7周的下降趋势经t检验分析有统计学意义(P=0.002,P=0.01)。随着菠菜生长时间延长,营养液经反复循环杀菌后,菌落总数没有显著增长,大肠菌群的数量反而下降,说明在菠菜生长过程中营养液的微生物增殖情况得到了有效控制。

图1 1—7周营养液的菌落总数Fig.1 Total number of colonies of nutrient solution in 1—7 weeks

图2 1—7周营养液的大肠菌群数量Fig.2 Number of coliforms of nutrient solution in 1—7 weeks

营养液杀菌消毒前后各个时间段供液端和回液端的菌落总数和大肠菌群数量均出现显著性下降(P＜0.05),说明使用臭氧杀菌的方法对减少营养液中菌落总数和大肠菌群数量有效果,避免了微生物在蔬菜生长过程中的大量繁殖,减少了后续成品蔬菜微生物污染的风险。

2.2 菠菜生长过程中营养液和蔬菜的致病菌检测

在培育过程中的第1周和第7周,分别对营养液(供液端、回液端)和水培菠菜进行沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7∕NM等致病菌的检测,结果均未检出。

2.3 菌种鉴定

从供液端营养液平板、回液端营养液平板、菜根平板、菜叶平板上分别随机挑取有不同菌落形态的菌落79株、85株、100株、80株,经MALDI-TOF MS鉴定,辅助以全自动细菌鉴定药敏分析系统,结果见表1—4。

表1 营养液回液端菌株鉴定结果Table 1 Identification results of bacterial strains at the return end of nutrient solution

从表1和表2可以看出,回液端的营养液经4—5 mg∕L的臭氧杀菌后,其所含的微生物种类有明显减少;其中占比最大的食酸菌属病原细菌是一种主要危害葫芦科植物的细菌[23],经杀菌后,占比并未减少,说明此种杀菌方法对该菌属的杀灭效果不明显;而易引起蔬菜腐烂变质的假单胞菌属的细菌数量由占比31.9%大幅降低至17.7%,杀菌效果明显;葡萄球菌等革兰氏阳性菌经臭氧杀菌后在供液端未检出。以上结果说明,该浓度的臭氧对营养液中部分有害细菌起到了明显的杀灭作用,可降低微生物污染风险。

表2 营养液供液端菌株鉴定结果Table 2 Identification results of bacterial strains at the supply end of nutrient solution

菠菜在移栽入栽培床时会将部分基质、土壤一并带入,这可能成为细菌生长的温床,并可能污染成品菜的叶片。从表3和表4可以看出,菠菜的根部分离出泡囊短波单胞菌、洛菲不动杆菌、恶臭假单胞菌等致病菌,但在菜叶中上述几种菌并未检出,且分离出的菌落种类从28种减少为19种,提示菠菜成熟后及时去除根部能有效减少致病性微生物交叉污染的风险,降低病害发生的可能性。在去根之后的菜叶细菌鉴定结果中可以发现,假单胞菌属的比例占50%以上,该菌属的细菌具有很强的产生氨等腐败产物的能力,且增殖速度极快,极易造成蔬菜腐败,这也是叶菜相对不易存放的一个重要因素。

表3 菜根菌株鉴定结果Table 3 Identification results of bacterial strains in vegetable roots

表4 菜叶菌株鉴定结果Table 4 Identification results of bacterial strains in vegetable leaves

3 结论与讨论

蔬菜的微生物污染是食源性疾病的主要风险来源,国外已发生多起食用生鲜蔬果引起的食源性疫情。如2011年美国18个州因食用被单增李斯特菌污染的哈密瓜暴发食源性疫情,导致146人患病,30人死亡;2016年美国因黄瓜暴发沙门氏菌疫情,导致至少907人感染,其中,204人住院,6人死亡;2018年美国32个州因生菜污染大肠杆菌O157:H7暴发疫情,导致172人食物中毒[24-25]。微生物污染可以发生在蔬菜供应链的不同环节,其中种植和加工是污染风险最大的环节[26]。无土栽培相对土壤种植能够更有效地控制微生物污染。研究发现,不同基质栽培的樱桃、番茄根际微生物菌落总数在土壤、稻壳、营养液栽培中依次减少;在用不同基质栽培甜瓜的研究中也发现,微生物数量表现为土壤＞碳化稻壳＞稻壳＞珍珠岩＞营养液[27],这些研究都说明水培方式相对于其他栽培方式更加安全可控。臭氧是一种非常强的氧化剂,具有很强的氧化力,如果有足够的曝气时间和浓度,可以杀死水中的所有生物,因此可以用来对营养液进行消毒[28]。本研究显示,在菠菜生长第1周至第7周成熟过程中,使用臭氧对营养液进行杀菌,营养液中微生物菌落总数始终保持相对稳定,大肠菌群数量有明显下降趋势,常见致病菌的检测均未检出;回液端的营养液经臭氧杀菌后,细菌种类明显减少,腐败菌占比明显下降,以上均说明水培蔬菜可以通过臭氧杀菌环节杀灭部分有害细菌,较好地控制种植环境,降低成品蔬菜的微生物污染风险。蔬菜成熟后及时去根加工,能够有效减少叶片中致病性微生物种类增长的风险,在一定程度上预防了交叉污染的可能性。建议企业在运输、贮存、加工蔬菜之前及时去根,以降低成品蔬菜的微生物污染风险。

本试验从水培蔬菜的营养液种植环境控制和成品菜去根加工两个关键环节对微生物污染风险进行了研究分析,为水培蔬菜微生物污染风险的后续研究提供了参考数据。