脱氢枞酸三羟甲基丙烷-丙二酸聚酯的制备及其胶束聚集研究

亓 坤，赵彦芝，许海棠，雷福厚，龙 寒，周菊英*

(1.广西民族大学 化学化工学院；林产化学与工程国家民委重点实验室；广西林产化学与工程重点实验室；广西林产化学与工程协同创新中心，广西 南宁 530006；2.广西民族大学 海洋与生物技术学院，广西 南宁 530006)

纤维素、淀粉、乳酸和植物油等天然产物已经被广泛用于制备复合材料[1-2]。天然产物松香由于羧基的高化学反应活性及结构中的共轭双键，其可被改性成各类单体用于制备聚合物。近年来，松香及其衍生物也受到广泛的关注。谭学才等[3]以自由基聚合法制备了松香的改性产物马来松香丙烯酸乙二醇酯并用作交联剂。Ma等[4]研究发现在脂肪酶催化和较温和条件下松香酸和豆油可发生酯化反应，但松香酸的反应效率很低。这些酯化方法和过程普遍存在空间位阻大、酯化转化率低等问题[5]。酯化形成的两亲聚合物可在水中、自组装形成胶束，聚合物胶束具有无毒、稳定性好等优点。聚合物胶束有球形、蠕虫状和层状等结构，具有独特的核壳结构，在表面活性剂[6]和生物医疗[7]领域得到了广泛关注。聚合物胶束可用于纳米材料制备[8]、磁成像[9]、吸附、表面改性[10]、药物传递系统[11]和水净化[12]等领域。具有亲水链段的松香酯及其聚合物在作为聚合物胶束方面具有潜在应用价值[13]。通过控制聚合物分子链的聚集可以制备聚合物胶束[14]。胶束的性质很大程度上取决于聚集胶束形成过程中的各种条件，如溶剂、温度和压力等[6,15]。脱氢枞酸(DHAA)是从歧化松香中分离得到的具有三环菲骨架结构的天然树脂酸，且羧基连接在DHAA分子中的手性碳原子上，这种结构为DHAA提供了广阔的应用空间。Zhou等[16]经苄位氧化、与水合肼缩合、与多种取代芳香酸发生亲核取代反应，合成了脱氢枞酸C-7酰腙衍生物并研究了其抗菌活性。Li等[17]将脱氢枞酸基苯并咪唑衍生物与氰乙酸乙酯基团偶联，设计合成了一种检测亚硫酸氢盐的荧光探针并应用于斑马鱼成像。本课题组[18]通过酰氯法成功合成了脱氢枞酸三羟甲基丙烷酯(DATE)，避免了直接酯化、酯交换等传统方法由于菲环空间位阻大而导致产物纯度低的问题，并研究了DATE在空气-水界面的吸附行为。本研究制备了脱氢枞酸三羟甲基丙烷-丙二酸聚酯(DMPE)，采用多种方法表征了其结构与性能，并探讨了DMPE聚集成胶束过程中高分子链的聚集与链形态的转变，以及聚集成胶束过程中的动力学，以期为枞酸基聚合物在表面活性领域的应用提供理论依据。

1 实 验

1.1 原料与试剂

脱氢枞酸三羟甲基丙烷酯(DATE，纯度为99%)，自制[18]。丙二酸、对甲苯磺酸(PTSA)、无水乙醇，均为市售分析纯。胎牛血清(FBS)，GIBCO公司；MEM培养基，HYCLONE公司；胰蛋白酶，生工生物；T25培养瓶、96及24孔培养板，CORNING公司；细胞计数试剂盒(CCK-8)，碧云天生物技术公司；BB-4126活细胞/死细胞染色试剂盒，贝博公司。

1.2 脱氢枞酸三羟甲基丙烷-丙二酸聚酯(DMPE)的合成

DMPE的合成路线见图1。在通有氮气的三口烧瓶中加入丙二酸1.09 g、脱氢枞酸三羟甲基丙烷酯4.22 g、对甲苯磺酸0.26 g。等温度到达120 ℃，药品融化后开始搅拌，每间隔1 h对反应体系进行减压蒸馏除去水分。7 h后结束反应并降温，将粗产物用Mn=3 000的透析膜透析1周，干燥后得产物脱氢枞酸三羟甲基丙烷-丙二酸聚酯(DMPE)。

图1 DMPE的合成路线

1.3 分析测试方法

1.3.1FT-IR分析 采用Nicolet IS10傅里叶红外光谱仪在400～4 000 cm-1波数范围内测试产物的红外光谱(FT-IR)[19]。

1.3.21H NMR分析 以Bruker Avance(600/400)MHz核磁共振光谱仪测试样品的核磁共振氢谱(1H NMR)，CDCl3为溶剂，TMS为内标物[20]。

1.3.3GPC分析 凝胶渗透色谱(GPC)利用配有Waters 2414折射率检测器和二元高效液相色谱泵的Waters 1525系统进行测试。洗脱液为四氢呋喃(THF)，流速设定为0.3 mL/min[21]。THF和样品使用孔径为0.2 mm的微孔滤膜过滤，采用聚苯乙烯标样(266、374、1 100、1 920、2 950、4 870、7 200、10 400、15 700、19 600、34 800和67 500 g/mol)。

1.3.4TG/DTG分析 采用耐驰STA449F3同步热分析仪进行热重(TG)分析，测试在氮气氛围下进行，从室温加热到700 ℃，升温速率为10 ℃/min。

1.3.5UV光谱测试 紫外吸收(UV)光谱采用日本岛津公司UV-1800型紫外光谱仪进行测定。

1.3.6RS光谱测试 瑞利散射(RS)光谱由美国Perkin Elmer公司LS-55型荧光光谱仪进行测定，RS光谱测定中狭缝宽度均为2.5 nm且λex=λem，测试范围为250～650 nm[22]。

1.4 DMPE的细胞毒性实验

DMPE的细胞毒性由CCK-8实验测定。当小鼠成纤维细胞(L929)细胞密度达到100%时，配制成4×104个/孔细胞悬液，计数，接种于96孔细胞培养板内，在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。分别加入10、20、50和80 μmol/L的DMPE，空白对照组为灭菌水，继续培养24 h。加入10 μL CCK-8孵育1 h，轻轻振荡10 min，利用Perkinelmer EnSpire酶标仪测定各样品的吸光度，测试波长为450 nm，重复5次。以细胞存活率反映实验过程中细胞的生长增殖情况，根据细胞毒性标准转化为毒性等级：细胞存活率=实验组吸光度平均值/空白对照组吸光度平均值×100%。

Live/Dead细胞荧光染色实验。L929细胞密度为100%时，消化并制成细胞悬液，计数，接种于24孔细胞培养板内(1.5×105个/孔)，在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。然后加入10、20、50和80 μmol/L的DMPE，对照组为灭菌水，继续培养24 h。2 410 r/min条件下离心5 min，轻轻去除上清液并洗涤2次(1 mL/孔的PBS溶液)，注入200 μL染色工作液(calcein AM灭菌水稀释1 000倍，PI染料灭菌水稀释20 000倍)，采用分开染色方案，calcein AM染色25 min，PI染色5 min。用OLYMPUS U-RFL-T荧光显微镜观察活细胞与死细胞(活细胞为黄绿色，死细胞为红色)，每个浓度平行测定4次。

1.5 DMPE的胶束聚集实验

采用RS光谱测定DMPE的胶束聚集过程[23]。分别配置质量浓度为0.01、0.03、0.05、0.10和 0.30 g/L 的DMPE水溶液，测定其连续降温(25 ℃→0 ℃)和升温(0 ℃→25 ℃)过程中的最大散射光强随温度的变化情况，从而判定胶束在变温过程中的聚集及形态转变过程。

2 结果与讨论

2.1 DMPE的结构与性能表征

图2 DMPE的FT-IR(a)、UV(b)和1H NMR(c)谱

2.1.4GPC分析 DMPE的GPC谱图见图3(a)，可以看出，其为单峰，DMPE的数均相对分子质量为3 900，重均相对分子质量为6 300，多分散系数为1.62，聚合度为7.8。此外，DMPE的重均相对分子质量主要集中在2 000～12 000区间内，达到总累计质量分数(Ht)上。

2.1.5TG/DTG分析 DMPE的热重分析曲线见图3(b)。由图3(b)可知，DMPE在320 ℃左右开始分解，质量损失50%时对应的温度约为400 ℃，此时DMPE的结构基本被破坏；450 ℃时，DMPE的质量损失接近90%，表明此时DMPE已经基本分解完全。而DTG曲线中480 ℃出现的小峰，说明聚合物中仍含有未除净的DATE单体。

图3 DMPE的GPC(a)和TG/DTG曲线(b)

2.1.6RS光谱分析 图4为不同质量浓度的DMPE水溶液在25 ℃的散射光谱。由图可以看出，DMPE在400 nm处有1个大的散射峰。由于此散射峰的位置远离217、228和268 nm这3个吸收峰，位于吸收带以外，所以归属为瑞利散射峰。同时可见散射峰强度随DMPE质量浓度的增大而增强，400 nm的散射峰强度的变化归因于不同浓度下胶束聚集从而形态发生转变，即随着DMPE质量浓度的增加，DMPE的形态由单一分散状态转变为聚集状态。

图4 DMPE水溶液的散射光谱(25 ℃)

2.2 DMPE的细胞毒性分析

根据细胞毒性分级标准[24]，当细胞存活率小于75%时，评价为有细胞毒性，故可由细胞存活率来判定DMPE的细胞毒性大小。当DMPE水溶液浓度为10、20、50、80 μmol/L 时，细胞存活率分别为113%、97%、90%和76%。可以看出，当DMPE水溶液浓度为10 μmol/L时，细胞存活率维持在一个相对较高的值，略大于100%，表明在此条件下L929细胞增殖；随着DMPE浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，表明较高浓度下，DMPE具有一定的生物毒性。不同浓度的DMPE培养的活/死细胞荧光显微镜观察结果见图5，可以观察到DMPE浓度大于10 μmol/L 时，死细胞数量随浓度的上升而增多，而在0～10 mmol/L浓度范围内，小鼠成纤维细胞表现为正常的增殖和凋亡，表明0～10 mmol/L浓度范围内DMPE具有良好的生物相容性。

图5 在不同浓度的DMPE水溶液中培养24 h后L929细胞荧光染色(×40)

2.3 DMPE变温过程中聚集胶束的形成过程分析

不同浓度的DMPE水溶液在降温过程中RS归一化强度(400 nm)-温度曲线如图6(a)所示。

图6 DMPE水溶液在降温(a)和升温(b)过程中RS归一化强度(I400)-温度曲线

由图可见，降温的初始阶段RS强度几乎是恒定的，随着温度的不断降低RS强度逐渐升高。这主要是因为随着温度的不断降低DMPE分子之间的作用力开始占主导，大于DMPE链段与溶剂之间的作用力，因而DMPE在降温过程中开始发生聚集。在这个过程中DMPE的疏水基团与水分子间作用力减小，而DMPE的疏水基团间的作用力增大，DMPE开始发生聚集，聚集体粒径变大从而导致RS强度逐渐升高。由图6(a)可知，当DMPE质量浓度为0.01、0.03、0.05、0.10和0.30 g/L时，DMPE开始聚集的温度(Tp)分别为4、7.5、7.5、11.5和14.5 ℃。由此可知，聚集温度随着DMPE质量浓度的增加而增大，这是由于在高浓度下分子链的扩散和碰撞概率增加。结果表明较低温度有利于DMPE链的聚集，RS强度最终会达到一个稳态。

为了探究DMPE胶束的解聚过程，可对降温后的DMPE溶液进行升温并记录升温过程中的RS强度变化。升温过程中PS归一化强度与温度的关系如图6(b)所示。由图可知，升温过程中散射强度变化几乎与降温过程相反，只是解聚的转折温度与降温过程相比有一定的滞后。当DMPE质量浓度为0.01、0.03、0.05、0.10和0.30 g/L时，DMPE解聚完成温度分别为6、17、17、21和23 ℃。这是因为降温过程中形成的胶束在后续升温中解聚过程缓慢。除此之外，高分子链之间的缠结也会导致解聚过程缓慢，解聚温度升高。

2.4 DMPE聚集胶束过程动力学分析

通过RS强度对时间依赖性考察DMPE链在聚集过程中的动力学过程。图7(a)为0.05 g/L DMPE溶液在各恒定温度下I400-时间依赖曲线。由图可见，各温度下I400-时间依赖曲线具有相同趋势，且随着温度的下降，曲线的斜率增大，这主要是因为温度下降分子链的聚集速率增大。

某一温度下相对聚集程度可由式(1)计算：

αt=(It-I0)/(I∞-It)

(1)

式中：αt—t时刻的相对聚集程度；I0，It—0时刻和t时刻的散射强度；I∞—聚集过程中的最大散射强度。

利用阿夫拉米方程可得到聚集过程的动力学方程，见式(2)和式(3)[25]：

ln[-ln(1-αt)]=lnkp+nlnt

(2)

(3)

式中：kp—速率常数；n—Avrami指数；A—与分子链的碰撞频率相关的指前因子,s-1；R—通用气体常数，8.314 J/(mol·K)；T—温度，℃；Ea—聚集过程的表观活化能，kJ/mol。

由式(2)的斜率和截距可分别计算得到kp与n，由式(3)的斜率和截距可分别计算得到Ea和A。图7(b)为0.05 g/L DMPE溶液等温聚集过程中的阿夫拉米曲线。由图可以看出，聚集初期和聚集后期是可以区分的，也即聚集初期为线性部分，而后期则发生在非线性区域。图7(c)为DMPE溶液(1/n)lnkp-1/T的曲线。经计算得到聚集胶束形成过程的所有动力学参数见表1，可以看出，在较低温度下DMPE溶液聚集成为胶束的速率常数和Avrami指数较高，而高温时较低。

图7 DMPE溶液(0.05 g/L)的I400-时间曲线(a)、Avrami曲线(b)及(1/n)lnkp-1/T曲线(c)

表1 DMPE在溶液中聚集形成胶束的动力学参数(0.05 g/L)

3 结 论

3.1以脱氢枞酸三羟甲基丙烷酯(DATE)和丙二酸(MA)为原料，合成了一种具有生物相容性的脱氢枞酸三羟甲基丙烷-丙二酸聚酯(DMPE)，并采用FT-IR、1H NMR、GPC、TG/DTG、UV和RS光谱对其结构和性能进行了表征。结果表明：DMPE已被成功合成，DMPE的数均相对分子质量为3 900，重均相对分子质量为6 300，多分散系数为1.62；DMPE在320 ℃左右开始分解，450 ℃时基本完全分解，在400 nm处有散射峰。

3.2DMPE的细胞毒性分析结果表明：DMPE水溶液在低浓度时对L929细胞具有增殖作用，随着浓度增加，细胞存活率逐渐降低；荧光显微镜分析表明DMPE具有良好的生物相容性。

3.3DMPE链在降温和升温过程中的胶束聚集和胶束解聚结果表明：聚集温度随着DMPE水溶液质量浓度的增加而增大，而胶束的解聚过程几乎是胶束形成过程的逆过程，可以观察到明显的滞后现象。DMPE的胶束聚集动力学分析结果表明：低温有利于胶束聚集；当温度为3 ℃时，Avrami指数(n)5.79，速率常数(kp)1.78×10-11，指前因子(A)1.55×1022s-1，表观活化能(Ea)-127.12 kJ/mol。