兰坪乌骨绵羊SLC17A8基因多态性与其乌质性状关联性研究

岳 丹，和晓明，任洪辉，刘兴能，朱俊红，邓卫东*

(1.玉溪农业职业技术学院 动物科技学院，云南 玉溪 653106；2.云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明650201)

SLC17A8基因编码囊泡谷氨酸转运蛋白(vesicular glutqmate transporter 3，VGLUT3)，该蛋白将神经递质谷氨酸转运到突触小泡中，然后再释放到突触间隙[1]。Hoogduijn等[2]和Adameyko[3]研究显示抑制谷氨酸受体会导致黑色素细胞结构发生转变，并且黑色素细胞合成过程中的中央调控因子MITF(microphthalmia associated transription factor)表达量急剧下降，推断SLC17A8可能与MITF具有相似的生物学功能。此外，在紫外线的照射下神经元可导致谷氨酸大量合成[4]，兰坪乌骨绵羊主产区位于高原，常年接受强紫外线的照射，可诱导兰坪乌骨绵羊大量合成谷氨酸[5]，SLC17A8在神经元内编码VGLUT3，推测SLC17A8与黑色素的合成密切相关。熊和丽[6]通过对兰坪乌骨绵羊全基因组测序并与世界多个品种绵羊全基因组重测序数据(10818G)进行联合分析，结果发现兰坪乌骨绵羊高密度遗传变异图谱显示基因内的突变主要在于内含子变异，并且SLC17A8有15个SNP在兰坪乌骨绵羊中具有高等位基因频率，经haploview分析，其中12个SNP高度连锁，在兰坪乌骨绵羊具有不同于兰坪普通绵羊的优势单倍型[6](图1)。目前对于兰坪乌骨绵羊种质的分子特征探究较少，大部分研究是从黑色素的合成路径和酶调控位点入手探究兰坪乌骨绵羊乌质性状的形成机理[7-10]。本文利用PCR技术对兰坪乌骨绵羊SLC17A8基因进行扩增，分析该基因的生物学特性，为后续SLC17A8在黑色素细胞的研究提供理论依据。

图1 SLC17A8中15个SNP在兰坪乌骨绵羊(A)及兰坪普通绵羊(B)的单倍型[6]

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验选取云南省兰坪县的兰坪乌骨绵羊和普通绵羊(各50只)血液作为研究样品。使用一次性真空采血管在绵羊颈部静脉采血，置于冰盒中暂存运输，后置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2 主要试剂

Soluene-350(PerkinElmer公司)；L-Dopa、酪氨酸酶(Sigma公司)；蛋白酶K(Merck公司)；RNase、ddH2O(北京天根生化科技有限公司)；琼脂糖、金牌MIX、DL2000 DNA Marker(昆明硕擎生物技术有限公司)；ExRed核酸染料(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)。

1.3 黑色素含量测定

采用光谱法分别测定[7]血液酪氨酸酶活力、脱黑色素含量、碱溶性黑色素含量、总黑色素含量、真黑色素与总黑色素的比值以及血浆比色。

1.4 基因组DNA的提取

采用血液基因组DNA纯化试剂盒(Genmark公司)提取绵羊血液DNA，具体步骤参照试剂盒说明书。提取的DNA于4 ℃保存备用。

1.5 引物设计

根据绵羊3号染色体(NC_040254)上SLC17A8基因全长序列，采用Premier premier 6.0软件设计11对外显子引物。SLC17A8基因11对引物序列信息见表1。

1.6 PCR扩增

PCR反应为25.0 μL反应体系，其中含金牌MIX(green)22 μL、DNA模板(20 ng/μL)1 μL、上游和下游下引物(10 μmol/L)各1 μL。PCR反应程序：98 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，退火温度见表1，退火10 s，72 ℃延伸10 s，30个循环后，72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，成像分析仪检测结果后送至昆明硕擎生物技术有限公司测序。

表1 引物序列信息

1.7 统计分析

2 结果与分析

2.1 黑色素含量测定结果

由表2可知，兰坪乌骨绵羊血浆TYR活性显著高于兰坪普通绵羊(P<0.05)。绵羊类群、性别以及年龄对血浆TYR活性具有显著影响(P<0.05)，但是三者的两两互作效应对TYR没有显著影响；脱黑色素含量两者差异不显著(P>0.05)。类群、性别、年龄以及三者间的两两互作效应对血浆脱黑色素含量没有显著影响(P>0.05)；碱溶性黑色素含量兰坪乌骨绵羊低于兰坪普通绵羊(P<0.05)。类群和年龄对血浆中碱溶性黑色素含量有显著影响(P<0.05)，性别以及三种互作效应对其没有显著性影响(P>0.05)；总黑色素两者差异不显著；真黑色素与总黑色素的比例兰坪乌骨绵羊显著高于兰坪普通绵羊(P<0.05)。除类群外，其余指标对真黑色素/总黑色素均无显著性影响；血浆比色兰坪乌骨绵羊显著高于兰坪普通绵羊(P<0.05)。

表2 兰坪乌骨绵羊与普通绵羊黑色素含量的比较及相关影响因素的方差分析

2.2 SNP位点的筛选

2.2.1SLC17A8基因PCR扩增 如图2所示，电泳片段与预期结果一致，测序后所得11对引物扩增产物片段大小分别是297、484、392、377、425、458、594、503、505、466、599 bp，将11段序列与引物源序列进行比对以及序列拼接，获得外显子总长度为1 770 bp的序列。

图2 兰坪乌骨绵羊SLC17A8基因外显子扩增电泳图

2.2.2 PCR产物测序结果 测序结果SLC17A8-EX3、SLC17A8-EX5、SLC17A8-EX6、SLC17A8-EX8、SLC17A8-EX9、SLC17A8-EX10的片段与绵羊(NC_040254)DNA序列比对相似性100%；SLC17A8-EX1与其相似性98.02%，此段序列共2个多态位点(C139T、G159A)；SLC17A8-EX2与其相似性98.80%，此段序列总共3个多态位点(G87A、A150C、C161A)；SLC17A8-EX4与其相似性98.26%，此段序列共2个多态位点(C149T、T158C)；SLC17A8-EX7与其相似性98.57%，该段序列共2个多态位点(C181T、T195C)；SLC17A8-EX11与其相似性99.22%，该段序列多态位点为T271C；SLC17A8-EX12与其相似性99.71%，该段序列多态位点为C173T。

整个片段共11个突变位点，其中EX1的第2个突变位点(G159A)和EX2的第1个位点(G87A)为错义突变，其余突变位点均为同义突变。G159A位点编码的氨基酸由Gly突变到Glu；G87A位点编码的氨基酸由Gly突变到Arg。

2.2.3SLC17A8基因多态性 兰坪乌骨绵羊与兰坪普通绵羊11个多态位点的基因型频率和等位基因频率如表3所示。

表3 绵羊SLC17A8基因多态位点基因型及等位基因频率

2.2.4SLC17A8基因多态性与乌质性状的关联性分析 乌骨绵羊的乌质性状主要通过黑色素含量指标进行量化，将11个多态位点的基因型与黑色素指标进行关联性分析，结果见表4。

表4 SLC17A8基因多态性与兰坪乌骨绵羊乌质性状的关联分析

将SLC17A8基因多态位点与兰坪乌骨绵羊乌质性状关联分析，结果显示在兰坪乌骨绵羊的不同位点(除EX2-C161A)不同基因型间绵羊酪氨酸酶活性具显著差异，其中EX1-C139T位点上CC型绵羊真黑色素/总黑色素指标含量显著高于CT型绵羊，EX1-G159A位点上GG型绵羊血浆比色显著高于GA型绵羊。在相同基因型不同绵羊类群间，所有位点不同类群绵羊间真黑色素/总黑色素指标具有显著差异(P<0.05)(除EX1-C139T位点上CT型绵羊)。其中EX1-C139T位点上CC型兰坪乌骨绵羊酪氨酸酶活性和碱溶性黑色素含量显著高于普通绵羊(P<0.05)；EX1-G159A位点上GA型兰坪乌骨绵羊脱黑色素、碱溶性黑色素和酪氨酸酶活力以及GG型碱溶性黑色素和血浆比色显著高于普通绵羊(P<0.05)；EX2-G87A位点上GG型碱溶性黑色素以及AA型脱黑色素、血浆比色和酪氨酸酶活性显著高于普通绵羊(P<0.05)；EX2-A150C位点上AA型兰坪乌骨绵羊脱黑色素和血浆比色以及酪氨酸酶活力显著高于普通绵羊(P<0.05)；EX4-C149T位点和EX4-T158C位点上CC型和CT型血浆比色以及CC型酪氨酸酶活力显著高于普通绵羊(P<0.05)；EX7-C181T位点上CC型兰坪乌骨绵羊碱溶性黑色素含量显著高于普通绵羊(P<0.05)；EX7-T195C位点上TT型和EX11-T271C位点上CC型兰坪乌骨绵羊酪氨酸酶活力和血浆比色指标显著高于普通绵羊(P<0.05)；EX12-C173T位点上CC型和CT型兰坪乌骨绵羊血浆比色以及CT型碱溶性黑色素显著高于普通绵羊(P<0.05)，其他指标差异均不显著(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 兰坪乌骨绵羊与普通绵羊血液黑色素含量分析

黑色素是兰坪乌骨绵羊体内重要的功能成分，黑色素的光保护作用、富集微量元素、增强机体抵抗力等功能都将促进兰坪乌骨绵羊药用价值和食用价值的发掘[11]。高含量的真黑色素是乌骨绵羊乌质性状形成的直接原因[12]，真黑色素的产生依赖于高水平的TYR活力，若TYR活力相对较低，则趋于脱黑色素的产生，故兰坪乌骨绵羊机体具有相对较高的真黑色素含量，真黑色素与总黑色素比例也较高，绵羊血浆中真黑色素与总黑色素比例会直接影响血浆比色[13]。因此，分析绵羊TYR活力、真黑色素和总黑色素比例、血浆比色等指标也具有理论依据。真黑色素最后通过黑色素细胞产生再通过血液运输到各组织器管，最后形成促使乌骨绵羊乌质性状的产生。但目前关于动物乌质性状的形成机理尚不明晰，其形成机理是培育更加优良的兰坪乌骨绵羊亟待解决的问题。

通过测定分析发现，除总黑色素和脱黑色素外兰坪乌骨绵羊的TYR活力、真黑色素/总黑色素、血浆比色等生化指标值均显著高于普通绵羊。乌骨绵羊血浆中TYR活力、真黑色素/总黑色素、血浆比色分别为377.010±21.910 IU/mL、0.320±0.010、0.089±0.007 OD/mL，显著高于普通绵羊的321.522±10.702 U/mL、0.251±0.004、0.071±0.035 OD/mL。

3.2 位点突变对蛋白功能的影响

本试验通过扩增SLC17A8基因的外显子区，在其外显子上共找到11个突变位点，其中EX1 G159A和EX2 G87A为错义突变，其余突变位点均为同义突变。G159A位点编码的氨基酸由Gly突变到Glu；G87A位点编码的氨基酸由Gly突变到Arg。核苷酸序列的改变会在mRNA水平上扰乱了相应区域的外显子剪接增强子基因序列，导致外显子剪接增强子不能被调控因子所识别，使得相应的蛋白出现截短，从而导致疾病的发生，且基因突变对蛋白质的三维结构及功能结构域起着至关重要的作用[14]。吴宣富等[15]采用PCR-SSCP和DNA测序技术，检测20例有家族史的有先兆和无先兆偏头痛患者，结果G2094A基因突变可能通过转录、转录后翻译以及翻译后加工等多环节中的某步骤影响蛋白质的表达，从而导致偏头痛的发生。Komar等[16]研究发现，MDRI基因的C3435T位点突变导致机体合成了不同结构和功能特性的蛋白质。秦丹卿等[17]对携带β-地中海贫血基因孕妇患者进行基因诊断，首次鉴定出一种突变类型CD29，该基因突变类型具有高度的地域异质性。这与兰坪乌骨绵羊和其他绵羊种群所处的地域差异一致，虽目前尚未关于兰坪乌骨绵羊乌质性状的产生与地域异质性的关联报道，但这对于进一步研究兰坪乌骨绵羊乌质性状的产生机理具有重要的指导意义。

3.3 SLC17A8基因多态性与兰坪乌骨绵羊乌质性状关联分析

前人研究表明SLC17A8基因编码的VGLUT3蛋白在啮齿类动物和人类视网膜无轴突细胞[18]、小鼠的肝脏、肾脏均有表达[19-21]；VGLUT3位于毛细胞突触囊泡膜上，对L-谷氨酸(底物)有着非常强的特异性，L-谷氨酸能特异将谷氨酸转运至突触后膜，产生动作电位，达到传递听觉信号的作用[22]。Obholzer等[23]以斑马鱼为研究对象，利用敲除技术将SLC17A8基因外显子2敲除，发现外显子2的缺失导致mRNA编码的VGLUT3蛋白数量减少，引起神经传递过程中突触小泡数量不足，在一级神经元的前提下无法产生动作电位，最终导致听觉信号传导失败。Fremeau等[24]对小鼠进行免疫组织荧光分析，结果显示SLC17A8蛋白在中枢神经系统广泛表达。SLC17A8基因突变主要通过引起Glu的释放减少，进而引起相应的疾病。兰坪乌骨绵羊由于生长于高原地区常年接受紫外线的照射而产生大量的Glu，但SLC17A8基因是否对兰坪乌骨绵羊黑色素的形成机理产生影响还需要进一步深入研究。

将兰坪乌骨绵羊与普通绵羊SLC17A8基因的11个多态位点的基因型与血浆中黑色素含量指标进行关联分析，结果显示在兰坪乌骨绵羊的不同基因型间EX1-G139A位点上CC型绵羊酪氨酸酶活性和真黑色素/总黑色素指标显著高于CT型绵羊；EX1-G159A位点上GG型绵羊血浆比色显著高于GA型绵羊，但酪氨酸酶活力显著低于GA型绵羊；EX2-C87A位点上AA型绵羊酪氨酸酶活力显著高于GG型和GA型绵羊，GG型绵羊碱溶性黑色素显著高于GA型；EX2-C161A位点上AA型绵羊脱黑色素含量显著高于AC型绵羊；EX4-C149T位点和EX4-T158C位点上三种基因型酪氨酸酶活力差异显著，其中CT基因型最高；EX7-C181T位点和EX7-T195C位点上TT型绵羊酪氨酸酶活力显著高于CC型和CT型绵羊。因此，CC、AA、CT和TT型为兰坪乌骨绵羊的优势基因型。

综上所述，SLC17A8基因的11个多态位点的突变可能影响机体内部糖蛋白的构象，因此可以推测SLC17A8基因的突变可能通过影响SLC17A8蛋白的构象而对SLC17A8蛋白功能造成影响，解除了SLC17A8对黑色素细胞的分化、分裂及转移的抑制作用，导致黑色素细胞不仅仅是迁移至皮肤、毛发等部位，而是通过迁移到达机体各组织器官，进而使得黑色素在乌骨绵羊各组织中均有表达，导致乌骨绵羊呈现出乌质性状，具体的影响机制还有待于进一步研究。

4 结 论

兰坪乌骨绵羊TYR活力、血浆比色、真黑色素/总黑色素指标显著高于普通绵羊，但碱溶性黑色素含量显著低于普通绵羊(P<0.05)；兰坪乌骨绵羊SLC17A8基因编码区序列长1 770 bp，编码589个氨基酸，共发现11个突变位点，其中外显子1的G159A和外显子2的G87A为错义突变，其余突变位点均为同义突变。G159A位点编码的氨基酸由Gly突变到Glu，G87A位点编码的氨基酸由Gly突变到Arg；兰坪乌骨绵羊与普通绵羊混合群体基因分布存在显著差异(P<0.05)，CC、AA、CT和TT型为兰坪乌骨绵羊的优势基因型。