橡胶树蛋白激酶HbBIN2基因的克隆、蛋白表达纯化及酶活分析

郭 靖，袁红梅

橡胶树蛋白激酶基因的克隆、蛋白表达纯化及酶活分析

郭 靖，袁红梅*

海南大学热带作物学院/海南省热带生物资源可持续利用重点实验室，海南海口 570228

橡胶树是天然橡胶的唯一材料来源。寒害是橡胶树面临的主要自然灾害之一，严重限制了橡胶树的生长发育和种植区域分布，克隆和鉴定橡胶树低温应答基因尤为重要。蛋白激酶BIN2（brassinosteroid insensitive 2）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调控植物应对低温胁迫中发挥重要作用，但橡胶树蛋白激酶HbBIN2还未被克隆与鉴定。本研究从橡胶树cDNA中成功克隆出，序列分析表明：的开放阅读框为1143 bp，编码380个氨基酸，蛋白的分子量为42.9 kDa，理论等电点为8.74，是亲水性蛋白且无跨膜结构域。将构建到原核表达载体pET28a上，转化大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株，摸索合适的诱导条件后成功诱导表达出HbBIN2蛋白。比较HbBIN2在不同的诱导温度（16、28、37℃）、诱导时间（3、6、12 h）和IPTG浓度（0.1、0.3、0.5 mmol/L）下的表达量，结果表明，HbBIN2在37℃，0.3 mmol/L IPTG诱导12 h的表达量最大。对HbBIN2蛋白体外纯化条件进行探索，结果表明，100 mmol/L咪唑能将目的蛋白完全洗脱。纯化HbBIN2蛋白并进行激酶活性鉴定，结果表明，该蛋白具有激酶活性。该研究为后续HbBIN2蛋白功能分析和橡胶树应对低温胁迫的调控机制研究提供参考，为橡胶树耐寒品种分子育种提供重要的基因资源。

巴西橡胶树；低温胁迫；BIN2；蛋白纯化；激酶活性

温度是影响植物生长发育、产量以及地理分布的重要环境因素[1-2]。低温能够使细胞结构发生变化，导致定位在细胞膜上的蛋白不能正常发挥作用，严重时会导致植物死亡[3]。为了抵御低温胁迫带来的伤害，在长期自然选择过程中，植物已经进化出一系列精密且复杂的防御机制来适应低温胁迫，其中较为著名的是ICE-CBF-COR信号途径[4]。ICE-CBF-COR转录级联反应在植物应对低温胁迫过程中发挥着至关重要的作用。当遭遇低温胁迫时，被迅速诱导表达，进而激活下游一系列冷应答基因（cold responsive, COR）的转录，增强植物对低温的耐受能力[4]。除了ICE-CBF-COR信号级联反应外，包括油菜素内酯（brassinosteroid）在内的植物激素在调控拟南芥低温胁迫应答过程中发挥重要作用[4]。油菜素内酯是一种植物甾体激素，在植物生长、发育以及应对生物胁迫和非生物胁迫中都发挥重要作用[4]。外源性施加油菜素内酯类似物EBR，可以降低低温胁迫下番茄幼苗中基因的表达[5]。糖原合酶激酶GSK3类激酶BIN2（brassinosteroid insensitive 2）是BR（brassinosteroid）信号通路中的重要调控因子，也参与调控植物的生物胁迫和非生物胁迫。有实验证明在棉花中，GhBIN2（brassinosteroid insensitive 2）与GhJAZ（jasmonate zim-domain）蛋白相互作用，在棉花抗黄萎病中起着负调节作用[6]。在大豆中，（brassinosteroid insensitive 2）提高了转基因拟南芥和大豆毛状根的耐盐性和抗旱性[7]。同时也有研究表明植物激素BR信号通路中的几个关键因子在植物抵御寒害中起重要作用。例如（brassinosteroid insensitive 1）和能够正调控CBFs的表达，导致下游基因的上升，进而正调控植物的耐寒性[8-9]；此外，通过降低的转录活性，导致的表达量下降，使植物对低温胁迫更敏感[10]。因此，是油菜素内酯信号通路中的关键因子，参与调控包括低温胁迫在内的多种逆境胁迫应答。

目前，虽然植物应对低温胁迫的分子机制在拟南芥中已经研究得比较透彻，但是橡胶树如何应对低温胁迫的分子机理研究仍处于起步阶段。橡胶树是天然橡胶的主要来源，原产地是亚马逊热带雨林。作为典型的热带作物，橡胶树对低温胁迫非常敏感[11-12]。寒害是我国橡胶树面临的主要自然灾害之一，严重影响橡胶树的生长发育和地理分布。因此，研究橡胶树的抗寒机制，选育抗寒性强的橡胶树品种显得尤为重要。橡胶树应对低温胁迫的机制研究还十分有限，目前橡胶树中ICE-CBF信号通路的关键基因[13]、[12, 14]已被相继克隆和鉴定，但橡胶树中调控ICE-CBF信号通路的关键因子还有待深入研究。在拟南芥中，蛋白激酶BIN2能够调控转录因子ICE1的稳定性进而负调控植物的耐寒性[10]，橡胶树中的HbBIN2的功能如何尚不清楚。本研究克隆鉴定了橡胶树中的基因并表达和纯化了HbBIN2蛋白，同时分析了HbBIN2蛋白激酶的活性。该研究旨在为后续HbBIN2蛋白功能分析和橡胶树应对低温胁迫应答的调控机制研究提供参考，为橡胶树耐寒品种育种筛选可靠的基因资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

橡胶树组培苗‘热研7-33-97’购于中国热带农业科学院橡胶研究所。RNA提取试剂盒购于BioTEKE生物技术有限公司，反转录试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，限制性内切酶购自NEB生物公司，酶、感受态细胞、蛋白预染Marker购自TRANS公司。质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购于诺唯赞生物科技股份有限公司，BeyoGold™ His-tag Purification Resin、Kinase-Lumi™超强型化学发光法激酶活性检测试剂盒购于碧云天生物技术公司。pET-28a载体由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1基因扩增与生物信息学分析 以拟南芥数据库（TAIR）中的AtBIN2蛋白序列为诱饵，在NCBI中用tblastn搜索到橡胶树中高度同源的基因。提取橡胶树的总RNA，反转录为cDNA，用特异性引物（F: ggatc­cATGGCTGATGATAAG;R: ctcgag­TCATGTCCCAGCCA）扩增。用SeqBuil­der对HbBIN2的序列进行分析。利用在线软件ProtParam（https://web.expasy.org/protparam）和ProtScale（https://web.expasy.org/protscale）对HbBIN2的理化性质及亲疏水性进行分析，利用TMHMM对HbBIN2的跨膜结构域进行分析，并用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy. org）同源建模HbBIN2蛋白的三级结构。

1.2.2 原核表达载体构建与鉴定 将扩增出的和pET-28a载体用HⅠ和Ⅰ两种限制性内切酶进行酶切。胶回收酶切产物后用T4连接酶进行连接，并将连接产物转化到大肠杆菌DH5α。挑取单菌落进行PCR扩增，并将PCR扩增结果为阳性的送测序。将测序正确的重组质粒pET28a-HbBIN2转化到BL21（DE3）中，并利用菌落PCR验证。

1.2.3 筛选和优化原核表达条件 将重组质粒pET28a-HbBIN2转化到BL21（DE3）中，将经菌落PCR鉴定为阳性的单克隆菌株转接到含有Kan抗生素的LB培养基中过夜培养。将过夜培养的菌株按1∶100的比例转接于LB液体培养基中，37℃摇床培养2～3 h后，测量值。当培养至值为0.6时，取出1 mL未加IPTG的菌液作为空白对照，剩余加入不同浓度的IPTG（0.1、0.3、0.5 mmol/L）进行诱导。在不同的诱导时间（3、6、12 h）及诱导温度（16、28、37℃）进行取样。将收集到的菌体用适量非变性裂解液（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl, pH 8.0）进行重悬，将重悬液和SDS上样缓冲液混匀后高温变性。每个样品取20 μL，经SDS-PAGE电泳检测pET28a-HbBIN2的原核表达情况，以找到最优的表达浓度、表达时间及表达温度。

1.2.4 重组蛋白纯化 将IPTG加入到100 mL菌液中至终浓度为0.3 mmol/L，37℃过夜表达。将菌体收集在50 mL离心管中，加入5 mL非变性裂解液重悬，样品置于冰盒内，超声破碎15 min（每次超声波破碎10 s，停止10 s，以防止样品过热导致蛋白降解），4℃离心，5000´，10 min。将上清加入平衡好的His-tag Purification Resin中进行蛋白纯化，用不同浓度的咪唑（50、100、150 mmol/L）洗脱，收集洗脱液取20 μL进行SDS-PAGE电泳，其余存放至‒80℃冰箱。

1.2.5 HbBIN2激酶活性检测 配制每孔反应液BIN2（5 μL）、激酶反应缓冲液（Tris-HCl 20 mmol/L、pH 7.5，MgCl210 mmol/L，NaCl 100 mmol/L，ATP 25 mmol/L，DTT 1 mmol/L）、激酶检测试剂（50 μL），共100 μL。对照组为PBS（5 μL）、激酶反应缓冲液（45 μL）、激酶检测试剂（50 μL）。每个实验设置3组重复。根据Kinase- Lumi™超强型化学发光法激酶活性检测试剂盒说明书制作ATP标准曲线。在0、0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、12、24 h分别检测ATP的剩余量。根据荧光强度得知ATP的剩余量，进而计算出ATP的消耗量。选取反应时间为1 h的荧光强度，根据ATP的标准曲线计算激酶活性。HbBIN2激酶活性(U/L)=(△×100 μL)/(斜率××HbBIN2)，△=HbBIN2荧光强度-PBS荧光强度，斜率=ATP标准曲线斜率，=1 h，HbBIN2=5 μL。

2 结果与分析

2.1 HbBIN2基因的克隆及生物信息学分析

利用特异性引物（F: ggatccATGGC­TGATGATAAG;R: ctcgag TCATGTCCC­AGCCA）和高保真酶Prime STARTM，以橡胶树叶片cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增产物条带大小约1100 bp（图1A）。经Sanger测序，扩增产物基因全长为1143 bp，与橡胶树基因组注释的序列完全相同。利用SeqBuilder对序列进行分析，编码380个氨基酸，分子量为42.9 kDa（图1B）。利用在线软件ProtParam（https://web. expasy.org/ protparam）对HbBIN2蛋白的理化性质进行分析，发现HbBIN2理论等电点（pI）为8.74，不稳定指数为42.16。利用ProtScale（https://web.expasy.org/ protscale）在线软件对HbBIN2进行亲水性和疏水性分析，结果表明HbBIN2为亲水蛋白（图1C）。利用SWISS-MODEL（https:// swissmodel. expasy. org）在线软件构建HbBIN2蛋白的三维结构，a-螺旋占总氨基酸数的36.58%、β-折叠占22.9%、无规则卷曲占40.53%（图1D）。对蛋白HbBIN2进行跨膜结构分析，发现该蛋白无跨膜区（图1E）。

图1 HbBIN2的扩增和生物信息学分析

2.2 原核表达载体pET28a-HbBIN2的构建与鉴定

为了研究蛋白激酶HbBIN2的功能，将HbBIN2构建到原核表达载体pET28a上，并将测序正确的重组质粒pET28a-HbBIN2转化到BL21（DE3）中。利用引物HbBIN2F/HbBIN2R进行菌落PCR检测，菌落PCR结果所得条带大小与预期一致（图2），表明pET28a-HbBIN2成功转化到BL21（DE3）中，阳性克隆可以用于诱导和纯化HbBIN2蛋白。

2.3 筛选和优化原核表达条件

为了研究HbBIN2在大肠杆菌BL21中的表达条件，本研究设置了不同的诱导温度、IPTG浓度以及诱导时间进行筛选。温度筛选结果表明，在IPTG浓度为0.5 mmol/L时，于16、28、37℃诱导9 h均能诱导出目的蛋白，其中在37℃下HbBIN2诱导量最大，表明37℃为最优诱导温度（图3A）。在最优诱导温度37℃诱导9 h条件下，比较分析了0.1、0.3、0.5 mmol/L 3个IPTG诱导浓度，结果表明，0.3 mmol/L IPTG为最适浓度（图3B）。将pET28a-HbBIN2菌株在37℃、0.3 mmol/L IPTG浓度下分别诱导3、6、9、12 h，结果表明HbBIN2在12 h诱导表达量最大（图3C）。综上，HbBIN2蛋白表达的最优条件为37℃，0.3 mmol/L IPTG诱导12 h。SDS-PAGE检测结果表明，在该条件诱导的HbBIN2蛋白大部分为可溶性蛋白（图3D）。

M: D2000 plus DNA marker.

M: Protein marker；CK：E. coli BL21（转化有pET28a-HbBIN2）菌株在IPTG诱导前的全蛋白。

2.4 蛋白纯化

将转化有pET28a-HbBIN2的BL21（DE3）菌株在37℃、0.3 mmol/L IPTG条件下诱导12 h，收集菌体并进行超声波破碎，取上清，利用Ni柱进行纯化。Wash buffer洗涤后，用50、100、150 mmol/L咪唑进行梯度洗脱。收集洗涤液及洗脱液，取20 µL样品进行SDS-PAGE检测。结果表明，50 mmol/L和100 mmol/L咪唑洗脱液（泳道4～5）均能洗脱出目的蛋白HbBIN2, 其中100 mmol/L咪唑将目的蛋白完全洗脱（图4）。

2.5 激酶活性测定

为了研究HbBIN2的激酶活性，本研究利用激酶活性检测试剂盒检测纯化的HbBIN2蛋白激酶活性。通过测定ATP的标准曲线，得出标准方程=5954+2122，²=0.9945，为ATP的剩余量。在1 h时，根据1.2.5中的公式算出HbBIN2的激酶活性为1.098 U/L。反应12 h以后，ATP的消耗量趋于平稳，不再上升，说明HbBIN2的磷酸化状态趋于平稳（图5）。

3 讨论

橡胶树（）是典型的热带雨林树种，对低温非常敏感[11]。低温显著限制了橡胶树的地理分布、生长发育和胶乳产量[11, 15]。我国是非传统植胶区，橡胶树经常遭遇低温寒害的影响，提高橡胶树品种的耐寒性具有重要意义。由于橡胶树全基因组测序相对较晚，并且橡胶树转基因技术还不成熟，橡胶树应对低温冷胁迫的分子机制研究还处于起步阶段，严重阻碍了利用分子生物学手段提高橡胶树冷耐受性的研究。克隆和鉴定橡胶树低温应答过程中的关键基因及阐明其调控橡胶树应对低温胁迫的机制对橡胶树耐寒品种的选育具有重要意义。为了抵御低温胁迫带来的伤害，在长期自然选择过程中，植物已经进化出一系列精密且复杂的防御机制来适应低温胁迫，其中研究最为广泛的是ICE-CBF低温应答信号途径[3, 16]。最近研究表明植物激素油菜素内酯（BR）能协调ICE/CBF冷信号通路调控植物耐冷性[3, 17]。例如，BR信号中的转录因子BZRⅠ/ BESⅠ和可以激活CBFs和下游基因的表达进而调控植物低温耐受性。此外，BR信号通路中的关键激酶BIN2可以通过磷酸化BZRⅠ/BESⅠ，降低和基因的表达，导致植物的耐寒性降低[8]。进一步研究表明，拟南芥的BIN2还能够磷酸化ICE1，从而导致抑制下游的表达负调控植物低温耐受性[10]。以上研究表明拟南芥中BIN2是调控植物低温应答的关键基因，但橡胶树中的基因还未被克隆与鉴定。本研究成功克隆出，其开放阅读框为1143 bp，编码380个氨基酸。

M：Protein marker；1：经IPTG诱导的细菌裂解液结合镍柱后的穿流液；2～3：Wash buffer洗脱杂蛋白的流出液；4～6：50、100、150 mmol/L咪唑洗脱液。

图5 HbBIN2自身磷酸化动力学曲线

蛋白质的磷酸化修饰是调控植物低温胁迫应答的重要蛋白质翻译后修饰调控方式。ABA信号通路中关键蛋白激酶OST1（open stomata 1），是第一个被证明能够磷酸化ICE1蛋白的激酶，正调控拟南芥抵御低温胁迫的能力[18]。在水稻中，OsMPK3可以增强OsICE1蛋白的稳定性和转录活性[19]。与此相反的是，拟南芥中的3个蛋白激酶MPK3、MPK6和GSK3-like BIN2通过磷酸化ICE1，降低ICE1蛋白的稳定性及其与下游靶标的结合能力，负调控拟南芥的耐寒能力[10, 20-21]。本研究在.BL21（DE3）菌株中成功诱导表达和纯化HbBIN2蛋白。在研究蛋白质磷酸化修饰的实验中，需要利用标签将目的蛋白纯化出来，因此经常会将目的蛋白与标签融合。标签的带电荷情况、大小、亲水性等是影响目的蛋白可溶性表达的重要因素。本研究采用的是His蛋白标签，研究表明使用His蛋白标签后，HbBIN2在上清和沉淀中均有表达，且在上清中的表达量比沉淀中多。在纯化HbBIN2蛋白的过程中，增加融合蛋白与镍柱基质低温结合时间，可提高His标签蛋白与镍柱的结合效率。在wash buffer中添加2 mmol/L咪唑，可提高目的蛋白纯度。激酶活性实验证明所纯化的HbBIN2蛋白具有激酶活性，并且本课题组未发表数据证明HbBIN2可以和橡胶树低温应答途径中的关键蛋白相互作用，暗示HbBIN2可能通过磷酸化该蛋白来调控橡胶树的耐寒性。我们将利用Phos-tag gel电泳-免疫印迹结合的蛋白质磷酸化分析方法做进一步的验证。

激酶调控自身活性的最普遍方式之一就是自身磷酸化。有报道表明，拟南芥中的AtBIN2能够磷酸化自身的Y200位点来改变自身的激酶活性[22]。Y200位点自身磷酸化后能够导致蛋白激酶BIN2活化，使其能够磷酸化特异性底物[23]。但融合蛋白的标签、蛋白的稳定性等都可能影响激酶活性。本研究表明，HbBIN2蛋白具有自身磷酸化的激酶活性，His标签并不影响BIN2的激酶活性，为进一步研究其磷酸化位点和功能，探究BIN2在橡胶树抗寒中的分子机理奠定基础，为橡胶树耐寒品种育种提供可靠的基因资源。

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Cloning, Expression, Purification and Enzyme Activity Analysis of Protein Kinase HbBIN2 from

GUO Jing, YUAN Hongmei*

College of Tropical Crops, Hainan University / Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource, Haikou, Hainan 570228, China

Rubber tree (Muell. Arg) is the exclusive commercial source of natural rubber because of its high productivity and superior product quality. Low temperature is a major abiotic stress that disadvantageously affect rubber tree growth and development, and ultimately limit ecological distribution. However, the underlying mechanisms ofcold stress response remain elusive. Identifying cold response genes in rubber tree and understanding the mechanisms regulating cold stress is of great potential value. BIN2 (Brassinosteroid Insensitive 2), a serine/threonine protein kinase, plays an important role in plant responses to cold stress, but HbBIN2 inhas not been cloned and characterized. In this study,gene was successfully cloned from. The open reading frame ofincluded 1143 nucleotides and encoded 380 amino acids, with predicted molecular mass of 42.9 kDa. The theoretical isoelectric point (pI) of HbBIN2 was 8.74. HbBIN2 was a hydrophilic protein, which had no transmembrane domain. The full-length CDS ofwas inserted into the polyclone sites betweenHⅠ andⅠ of the prokaryotic expression vector pET-28a for generating the recombinant plasmid pET28a-HbBIN2. The recombinant plasmid pET28a-HbBIN2 was transformed intoBL211 (DE3) strain to induceHbBIN2 protein expression. By comparing the expression levels of HbBIN2 at different induction temperatures (16, 28, 37℃), induction time (3, 6, 12 h) and IPTG concentration (0.1, 0.3, 0.5 mmol/L), The results demonstrated that the optimal induction expression condition of HbBIN2 was at 37℃ for 12 h with 0.3 mmol/L IPTG. In addition, the purification conditions of HbBIN2 proteinwere then explored, and the optimal concentration of imidazole for purifying HbBIN2 was 100 mmol/L. The kinase activity assay demonstrated that the purified HbBIN2 had kinase activity i. This study would lay a foundation for further research on the functional analysis of HbBIN2 protein and the regulatory mechanism ofcold stress response, and provide elite gene resource forrubber tree breeding for cold resistance.

;low temperature stress; BIN2; protein purification; kinase activity

S794.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.001

2022-01-28；

2022-02-28

国家自然科学基金项目（No. 31870245）；海南省自然科学基金项目（No. 321RC478）。

郭 靖（1995—），女，硕士研究生，研究方向：作物遗传育种。*通信作者（Corresponding author）：袁红梅（YUAN Hongmei），E-mail：yuanhongmei@hainanu.edu.cn。