秋水仙素对猪屎豆的诱变及同源四倍体种质创制的研究

倪成凤，冷青云，虞道耿，张 瑜，刘国道*，杨虎彪*

秋水仙素对猪屎豆的诱变及同源四倍体种质创制的研究

倪成凤1,2，冷青云2，虞道耿2，张 瑜2，刘国道2*，杨虎彪2*

1. 海南大学热带作物学院，海南海口 570228；2. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南海口 571101

猪屎豆是重要的农业植物资源，在绿肥、饲用和药用等方面都有重要的开发潜力，然而目前关于猪屎豆的品种培育还处于空白，生产上缺乏优良品种导致生产性能参差不齐的问题突出，开展多倍体育种研究可为今后猪屎豆种质资源创新利用和培育新品种奠定材料基础。本研究以二倍体猪屎豆为实验材料，通过不同质量浓度秋水仙素和不同处理时间对猪屎豆露白种子进行多倍体诱导，探讨秋水仙素对二倍体猪屎豆的诱变效果，并利用流式细胞倍性检测和根尖染色体核型分析对诱变后代的倍性进行检测，进一步比较分析二倍体和同源四倍体的气孔和保卫细胞大小以及叶片和种子形态等特征变化。结果表明：与对照相比，秋水仙素处理抑制了猪屎豆种子胚根的生长和下胚轴的伸长，使种子胚轴发生诱变而缩短变粗。研究发现以100 mg/L的秋水仙素浓度浸泡12 h时猪屎豆种子四倍体诱导率最高，为13.33%，总体效果最佳。与二倍体相比，同源四倍体植株叶片下表皮的气孔长度和宽度、保卫细胞长度和宽度显著增加而气孔密度显著降低；同源四倍体植株的叶片宽度和叶柄宽度显著增加，而叶片长度和叶柄长度显著缩短；同源四倍体植株的叶形指数显著减小。此外，同源四倍体植株所获种子较二倍体显著增大，种子百粒重较二倍体显著增加。综上所述，本研究掌握了秋水仙素诱导加倍猪屎豆的方法，并成功获得了同源四倍体猪屎豆新种质，为猪屎豆遗传育种及相关基础研究奠定了种质基础。

猪屎豆；秋水仙素；诱导；同源四倍体

猪屎豆（，2n=2x=16）为豆科猪屎豆属植物。该物种不仅具有药用价值还是优质的绿肥作物，在饲用方面也具有潜力，创新利用的前景较广[1]。目前，对于猪屎豆的研究多集中在化学成分、药理活性、绿肥和园林绿化等方面[2-6]，对于农艺性状和高效栽培方面的研究较少。此外，关于猪屎豆资源评价及创新利用的研究十分薄弱，对于猪屎豆种质创制及新品种培育方面的研究处于空白。

多倍体诱导对种质资源利用和新种质的形成具有重要意义，在种质资源创新方面发挥着重要作用。一般而言，多倍体植物大多表现出与其二倍体不同或更优良的表型特征[7]，如茎较粗壮、叶片大而肥厚、花朵和果实变大等，细胞体积亦随着染色体数目的增加而增大[8]。通过染色体加倍可使基因组直接复制而基因型保持不变，但遗传物质倍增，从而达到植株生长健壮、非生物胁迫耐受性增强、各种营养物质和代谢物含量增多的目的[9-11]，多倍体诱导还可应用于克服远缘杂交不亲和障碍[12]，因此多倍体诱导在植物育种中占据着重要地位，广泛应用于各类植物的育种计划中。其中，利用抗有丝分裂剂秋水仙素诱导产生多倍体是目前常用的方法。早在1937年，秋水仙素就被应用于提高植物的倍性水平，且成功地诱导出四倍体曼陀罗[13]。目前，秋水仙素诱导加倍技术已在蔬菜[14]、花卉[15]以及药用植物[16]种质创制中得到广泛应用，在扁蓿豆[17]、紫花苜蓿[18]、柱花草[19]等豆科牧草育种中也有应用。秋水仙素的诱变效应与植物种类、秋水仙素浓度、处理时间等多种因素有关联[20]，不同植物种类最佳诱导效果所需的处理组合是不同的，如刘美妍等[14]诱导黄瓜萌动种子最佳组合为0.40%秋水仙素处理4 h，四倍体诱导率为18.00%；陆建农等[21]诱导葛属种子最佳处理组合为0.15 g/L秋水仙素处理48 h，四倍体诱导率为18.75%；徐鹏飞等[22]诱导毛竹吸胀种子最佳组合为0.5 g/L秋水仙素处理72 h和1 g/L秋水仙素处理24 h，诱导率均可达5.00%。不同作物的耐受性有显著差异，掌握最佳的秋水仙素浓度和处理时间是提高诱导效率的关键。

猪屎豆是重要的农业植物资源，由于缺乏优异的栽培品种，导致多种生产弊端逐渐显露，例如产量不一、生长期不一致、抗病性不一等问题。本研究拟通过秋水仙素诱导加倍的方法，创制四倍体种质，一方面是达到提升猪屎豆生产性能的目的；另一方面可利用加倍后的四倍体种质与同属近缘四倍体种质开展种间杂交，改良猪屎豆品质性状，为培育健康饲料资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为二倍体猪屎豆种子，由国家热带牧草种质资源中期（备份）库提供。选颗粒大小相似且饱满的二倍体猪屎豆种子，置于有湿润滤纸的培养盒中，在25℃恒温箱中黑暗条件下进行处理并直至种子露白。

1.2 方法

1.2.1 秋水仙素诱导处理 经预处理的猪屎豆露白种子，采用不同秋水仙素溶液浓度和不同处理时间的双因素处理试验，质量浓度分别为0（CK）、50、100、200 mg/L，并每个处理加入2%二甲基亚砜，处理时间设为12、24、48 h。将种子置于25℃、150 r/min的摇床中避光震荡处理。按上述试验方法布置2组试验，每个处理组25粒种子，3次重复。处理结束后，用蒸馏水冲洗3～5遍后播种于盆钵中。播种6 d后选取其中一组观察并统计不同秋水仙素浓度和时间处理组合下胚根长度、胚轴长度和胚轴直径的变化情况，另一组继续常规水肥管理。

1.2.2 出苗率、形态变异率的观测 自播种后第4天起，每隔2 d统计一次种子出苗及存活情况。种子播种6 d后统计出苗率；待幼苗生长14 d后，根据植株外部形态变化：下胚轴膨大，整个胚轴增粗、植株矮小等确定为形态变异苗，计算形态变异率；将对照和形态变异幼苗继续培养，并统计其存活株数。

出苗率=播种6 d后每处理出苗数/每处理种子总数×100%

形态变异率=播种14 d后变异苗数/14 d后存活苗数×100%

1.2.3 诱导植株的倍性鉴定 参考冷青云等[23]的倍性鉴定方法，以二倍体猪屎豆为对照，取对照植株和存活的形态变异植株嫩叶0.1 g，加入1 mL WPB细胞裂解液的器皿中切碎过滤，再加入50 μL DAPI染色剂，等待5 min后上机检测。根据流式细胞仪检测结果统计诱导率。诱导率=（纯合或混倍）株数/处理种子总数×100%

参考冷青云等[24]的染色体制片方法，以二倍体猪屎豆为对照，取对照和经流式细胞仪检测的四倍体植株进行根尖体细胞染色体制片，选择制片较好的染色体在Leica DM 2500生物显微镜下观察并保存图片。

1.2.4 猪屎豆同源四倍体和二倍体表型特征比较 选取对照和四倍体猪屎豆植株相同部位的叶片，将指甲油涂抹于待测叶片下表皮，晾干成膜后用透明胶带将表皮轻轻撕下，然后将胶带固定于载玻片上，在Leica DM2500生物显微镜下观察并拍照测量。每种倍性选5株，每株取1片叶片，每片叶片保存5个视野，统计单位面积下的气孔数并计算气孔密度，且每片叶片随机选取20个保卫细胞和气孔，测量长度、宽度，并进行比较分析。

气孔密度（个/mm2）＝各视野中气孔个数/视野真实面积（mm2）。

选取对照和四倍体猪屎豆植株近似部位的叶片，每个倍性选5株，每株取3片叶片，测量其叶长、叶宽、叶柄长和叶柄宽等形态指标，并计算叶形指数（叶形指数=叶长/叶宽）。利用Videometer Lab4种子表型成像分析系统对经秋水仙素诱导所获二倍体和四倍体猪屎豆种子表型性状进行比较和分析。

1.3 数据处理

利用Excel 2019和SPSS 25.0软件进行数据整理和分析。

2 结果与分析

2.1 不同秋水仙素浓度和处理时间对猪屎豆种子出苗率和胚根胚轴的影响

对处理后种子进行定期观察并统计其出苗情况，发现对照种子播种2 d后全部出苗，出苗速度一致，而在不同秋水仙素浓度和不同时间处理时出苗较缓慢且不整齐，随着生长进程的推进出苗数不规律增加，约6 d后达到稳定，随后幼苗逐渐出现不同程度死亡。因此，对播种6 d的种子出苗率进行统计分析。如图1所示，经秋水仙素处理后，猪屎豆露白种子出苗率随秋水仙素浓度和处理时间的增加呈不同程度地下降。处理时间为12 h时，秋水仙素各处理浓度下出苗率均在96%以上且与对照之间差异均不显著，对猪屎豆露白种子出苗率影响较小；处理时间为24 h时，秋水仙素各处理浓度下出苗率在85%～87%之间，与对照差异显著；而以更长时间48 h处理时，出苗明显受到阻碍，其中以浓度为100 mg/L秋水仙素溶液处理时最低，出苗率仅为29.33%，而以浓度为200 mg/L秋水仙素溶液处理时，出苗率比在其余2个浓度下高，可能是因为前期秋水仙素对此处理下猪屎豆露白种子抑制作用还未表现，为此重点观测了后期幼苗生长和存活情况。以低浓度50 mg/L处理时，2个处理时间12、24 h与48 h之间的出苗率差异显著，而以更高浓度100 mg/L和200 mg/L处理时，出苗率随着处理时间的增加而减小，不同处理时间之间的出苗率差异显著。

不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

同时观察发现，通过不同质量浓度的秋水仙素溶液和不同时间处理结束6 d后，对照猪屎豆露白种子正常生长，而用秋水仙素处理后其生长速度减慢，幼芽整个胚轴明显缩短且变粗。对每个处理组合猪屎豆胚根和胚轴变化进行测量分析，如表1所示，当处理时间相同时，除浓度50 mg/L秋水仙素溶液处理12 h外，其余所有秋水仙素浓度处理的猪屎豆种子胚根长度均显著低于对照；当秋水仙素浓度相同时，随着处理时间的增加，猪屎豆的胚根长度也呈缩短趋势，且3个处理时间之间差异显著，其中以200 mg/L秋水仙素溶液处理24 h和48 h后，其胚根长度最短仅8 mm左右。与对照相比，以不同秋水仙素浓度和时间组合处理猪屎豆露白种子，对其胚轴的生长具有明显的抑制效应，总体表现为胚轴长度显著（<0.05）降低，而胚轴直径显著增加。上述结果表明，与其余处理组合相比，以低浓度50 mg/L的秋水仙素溶液处理12 h、24 h和48 h时，猪屎豆种子的下胚轴发生诱变而缩短变粗，而此时的胚根生长受到的影响较小。

表1 不同秋水仙素浓度和处理时间对诱变种子胚根和胚轴的影响

注：不同小写字母表示处理间差异显著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters indicate significant difference among treatments (<0.05).

2.2 秋水仙素处理后猪屎豆幼苗形态变化

待播种14 d后，诱导植株在形态上发生明显变异。如图2所示，对照二倍体猪屎豆幼苗正常生长（图2C），经秋水仙素处理后，猪屎豆幼苗的根系和胚轴发生较大变化。根据不同的形态变异特征分为2种类型。类型1（图2A）：株高与对照相比无明显差异且都有真叶，而形态变异幼苗下胚轴膨大，胚根较短，根系较少。类型2（图2B）：形态变异幼苗生长明显受到抑制，整个胚轴缩短增粗，生长缓慢无真叶冒出，胚根明显缩短，根系缩短。根据统计，当以浓度为50 mg/L和100 mg/L秋水仙素处理猪屎豆露白种子12 h和24 h时，变异苗形态特征均含有类型1和类型2；当以浓度为50 mg/L和100 mg/L秋水仙素处理猪屎豆露白种子48 h时，变异苗形态特征为类型2；当以浓度200 mg/L秋水仙素处理12、24、48 h时，变异苗形态特征均为类型2。

对生长14 d的幼苗的存活及变异情况进行统计分析。如表2所示，在不同秋水仙素浓度和时间处理下，猪屎豆幼苗存活株数不同程度的减少，而同时猪屎豆幼苗形态基本都发生不同类型的变异。其中，以浓度为100 mg/L和200 mg/L处理时，形态变异率高达100%。处理时间为48 h时，但存活株数显著降低。

图2 秋水仙素处理幼苗变异特征

表2 不同秋水仙素浓度和处理时间幼苗形态变异率统计

2.3 诱导植株的倍性鉴定

待幼苗长至4～5片真叶时，用流式细胞仪检测诱变植株的倍性。检测结果从叶片细胞DNA含量分布图可以看出，对照材料二倍体的荧光强度在6300处出现单峰值（图3A）；12 600处出现单峰值初步确定为四倍体（图3B）；同时在6300和12 600处出现峰值为混倍体（图3C）。

为进一步验证流式细胞仪检测的诱导植株的倍性，经核型分析，最终证实对照猪屎豆二倍体植株根尖细胞的染色体数目为2n=2×=16（图4A），诱导植株根尖细胞的染色体数目为2n= 4×=32，属于诱导加倍的四倍体种质（图4B）。

图3 不同倍性猪屎豆植株的叶片DNA相对含量

图4 猪屎豆二倍体和四倍体植株染色体数目比较

统计对照和形态变异幼苗的存活情况，并对检测结果统计分析，如表3所示，以浓度为100 mg/L秋水仙素溶液处理种子12 h，四倍体诱导率为13.33%；以浓度为50 mg/L秋水仙素溶液处理种子24 h，四倍体诱导率为8%。经以上2个秋水仙素浓度和时间组合处理猪屎豆露白种子可以获得较高的诱导率，总体以100 mg/L秋水仙素溶液处理种子12 h的诱导率最高，效果最佳。此外，与全部存活的对照植株相比，形态变异幼苗存活株数随着秋水仙素浓度和时间的增加而减少，因此可在处理时适当增加种子的数量以此获得较多的四倍体植株。

2.4 猪屎豆四倍体种质和二倍体种质的表型特征比较

多倍体植株区别于正常植株的一个显著特征是气孔大，气孔密度变小。如图5所示，四倍体和对照猪屎豆植株在植物叶片下表皮的保卫细胞长和宽、气孔长和宽以及气孔密度上会有所差异，经测量比较（表4），四倍体猪屎豆叶片下表皮的保卫细胞平均长度和宽度分别是对照二倍体的1.57倍和1.50倍；四倍体猪屎豆叶片下表皮的气孔长度和宽度分别是对照二倍体的1.70倍和1.61倍，而四倍体猪屎豆叶片下表皮的气孔密度较对照二倍体降低了51.66%。由此可见，随着倍性的增加，猪屎豆植物叶片下表皮的气孔和保卫细胞显著增大而气孔密度显著降低，体现了多倍体的巨大性。

表3 不同秋水仙素浓度和处理时间对猪屎豆种子的诱导效果

图5 猪屎豆二倍体（A）和四倍体（B）植株气孔和保卫细胞

表4 猪屎豆二倍体和四倍体植株气孔和保卫细胞比较

注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters after the same column of data indicate significant difference (<0.05).

猪屎豆四倍体种质与二倍体种质的叶片表型发生变化，与二倍体相比（图6A），四倍体植株的叶片叶缘不平、叶面褶皱、叶质肥厚（图6B）。进一步对四倍体种质和二倍体种质的中央小叶叶长、叶宽、叶形指数（叶长/叶宽）以及三出复叶叶柄长和叶柄宽进行测量比较，结果显示，四倍体种质的中央小叶长度、宽度、长宽比以及三出复叶叶柄长、叶柄宽分别是二倍体的0.90倍、1.25倍、0.72倍、0.76倍和1.29倍（表5）。由此可见，四倍体猪屎豆植株的叶片宽度和叶柄宽度较二倍体显著增加，而叶片长度、叶柄长度以及叶形指数较二倍体显著降低。

图6 猪屎豆二倍体（A）和四倍体（B）植株叶片形态特征

表5 猪屎豆二倍体和四倍体叶片形态特征比较

注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters after the same column of data indicate significant difference (<0.05).

与二倍体猪屎豆种子相比，四倍体猪屎豆的种子明显发生变化（图7）。经测量比较（表6），四倍体种子面积、粒长、粒宽、粒宽/粒长和百粒重之间均有显著差异。四倍体面积、粒长、粒宽、粒宽/粒长分别是二倍体的1.27倍、1.13倍、1.11倍、0.98倍。四倍体百粒重为1.372 g，比二倍体种子增加了0.429 g。由此可见，与二倍体相比，四倍体猪屎豆植株所获种子显著增大，种子百粒重显著增加。

3 讨论

秋水仙素是作物倍性育种中常用的化学诱导剂，主要用于干扰细胞正常分裂，阻碍纺锤体的形成，使染色体数目增加，然后获得同源多倍体[25]。但是秋水仙素毒性较大，种子在处理过程发生失活，或者对后期种子的萌发及幼苗生长产生影响。例如徐佳琦等[26]用秋水仙素处理洋紫荆种子，其成苗率随着秋水仙素浓度的增加逐渐降低，且种子胚根生长受损而缓慢或者不继续生长。张锡庆等[27]用秋水仙素对有斑百合进行多倍体诱导研究显示，萌发种子胚根生长受阻而变慢，而下胚轴膨大变粗。程志号等[28]以浸泡法处理火龙果露白种子，受秋水仙素毒害作用使后期幼苗相继死亡。本研究利用秋水仙素处理猪屎豆露白种子，与对照相比，主要变化表现为露白种子生长较缓慢，胚根长度变短，甚至在较高秋水仙素浓度和较长时间处理之后，胚根因受到毒害几乎停止生长。秋水仙素处理时间越长，出苗率就越低，当处理时间为48 h时，出苗率急剧下降，而以短时间处理出苗率虽较高，但仍受毒性影响，部分幼苗后期依旧不能正常长出真叶而死亡。研究发现，诱变处理后形态变异苗后期存活株数随着秋水仙素浓度和处理时间的增加而逐渐减少，当秋水仙素浓度达200 mg/L时，幼苗受秋水仙素的影响而生长受阻，存活数最高仅10株。经检测发现仅在100 mg/L+12 h和50 mg/L+24 h两种处理组合下有较高的四倍体诱导率，分别为13.33%和8.00%，其余各处理组合下四倍体诱导率很低或者检测结果大多是生长不稳定的混倍体植株。因此，就秋水仙素浓度和处理时间影响的各因素综合考虑，以100 mg/L的秋水仙素浓度浸泡猪屎豆露白种子12 h，四倍体诱导率最高，诱导效果最佳。

图7 猪屎豆二倍体（A）和四倍体（B）种子形态特征

表6 猪屎豆二倍体和四倍体种子表型特征比较

注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters after the same column of data indicate significant difference (<0.05).

在植物倍性育种中，随着倍性的变化，植株细胞内遗传物质的含量也会相应的出现变化。利用流式细胞仪进行植物倍性鉴定不仅可以较短时间分析和测量大量细胞，而且DNA含量的变化可直接在分布图上显示[29]，且不受取材部位和时间的影响。流式细胞仪检测倍性操作不会受限于取材部位和时间，取材量小可大量鉴定，弥补了染色体计数法取材苛刻，操作复杂的缺陷。本研究利用流式细胞仪对秋水仙素诱导的猪屎豆进行倍性鉴定，发现对照二倍体的荧光强度在6300处出现单峰值，疑似诱导加倍四倍体的荧光强度在12 600处出现单峰值。进一步开展的核型分析确定了对照材料二倍体的根尖细胞染色体数目为2n=2x=16，而诱导加倍材料的根尖细胞染色体数目为2n=4x=32，确定为诱导成功加倍的四倍体新种质。由此认为，在猪屎豆倍性育种中，对诱导材料的倍性检测可用快速便捷的流式细胞仪检测。

因染色体的加倍效应，同源四倍体植株的形态表型与二倍体植株相比常表现出明显的差异，通常表现在部分植物器官的巨大性变化，例如漆慧娟[30]在甜叶菊多倍体诱导中发现同源四倍体具有叶片气孔和保卫细胞显著增大而气孔密度明显变小的特点，武江等[31]开展萱草多倍体诱导研究，结果发现，四倍体叶片比二倍体短而宽、叶形指数明显减小，王强[32]比较同源四倍体和二倍体豇豆表型特征显示，四倍体植株叶片、果荚均变大，而吴繁花[19]在柱花草同源四倍体诱导中同样发现四倍体植株气孔、叶片和种子都显著大于二倍体。在本研究中，与二倍体猪屎豆相比，同源四倍体植株叶片气孔和保卫细胞明显变大而气孔密度降低，叶片长度缩短而宽度增加，叶形指数变小，四倍体种子变大，百粒重增加，植物总体表现为叶片大、茎粗、种子百粒重增大等多个生长势提升的性状表现。本研究掌握了秋水仙素诱导加倍猪屎豆的方法，并成功获得了同源四倍体猪屎豆新种质，该种质在生长表型性状上较对照二倍体材料具有明显优势，该四倍体种质为猪屎豆遗传特性研究及品质改良提供了极为重要的材料基础，此外对于更多同源四倍体的各种特性还需进一步开展同源四倍体子代研究。

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Mutagenesis ofby Colchicine and Autotetraploid Germplasm Innovation

NI Chengfeng1,2, LENG Qingyun2, YU Daogeng2, ZHANG Yu2, LIU Guodao2*, YANG Hubiao2*

1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China

is an important agricultural plant resource, which has important development potential in green manure, fodder and medicine, but at present, there are no cultivated varieties ofThe production drawbacks caused by germplasm heterozygosity in production are gradually revealed,the exchange of genes related to fine agronomic traits among germplasm is restricted, so the research on polyploid breeding can lay a material foundation for the innovative utilization ofgermplasm resources and the cultivation of new varieties in the future. In this study, in order to investigate the mutagenesis effect of colchicine on, the polyploid induction ofseeds with different concentrations of colchicine and different treatment time were conducted. Then, the ploidy of the progenies was detected by flow cytometry and root tip karyotype analysis. Furthermore, the stomatal and guard cell size, leaf and seed morphology of diploid and autotetraploid were compared. The results showed thatcompared with the control, colchicine treatment inhibited the growth of the radicle and the elongation of the hypocotyl ofseeds, and the hypocotyl was obviously shortened and thickened. Concentration soaking in 100 mg/L for 12 h had the best induction effect, the induction rate was 13.33%. Compared with diploid, the stomatal length, stomatal width, guard cell length and guard cell width of the lower epidermis of the leaves of the autotetraploid plants significantly increased while the stomatal density significantly decreased; the leaf width and petiole width of the autotetraploid plants significantly increased, while the leaf length and petiole length significantly decreased, and the leaf shape index of autotetraploid plants significantly decreased. Compared with the diploid, the seeds obtained from autotetraploid plants significantly increased, and the weight of 100 seeds significantly increased. This study reveals the method of colchicine-induced doubling of, obtained the autotetraploidgermplasm, which would lay the germplasm foundation for the genetic breeding and related basic research of.

; colchicine; mutagenesis; autotetraploid

S551

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.010

2022-03-01；

2022-03-25

国家科技基础资源调查专项“中国南方草地牧草资源调查”（No. 2017FY100600）。

倪成凤（1996—），女，硕士研究生，研究方向：草种资源保护。*通信作者（Corresponding author）：刘国道（LIU Guodao），E-mail：liuguodao2008@163.com；杨虎彪（YANG Hubiao），E-mail：yanghubiao@163.com。