卵黄抗体在水产疾病防治中的研究应用进展

范贤平，蒋 葛，乔 毅，沈 辉*，徐军田

(1.江苏海洋大学海洋生命与水产学院，江苏连云港 222000；2.江苏省海洋水产研究所，江苏南通 226007)

近年来，我国水产养殖业发展迅速，养殖产能长期处于世界首位。随着高密度、工厂化、集约化养殖模式的建立和推广，水环境污染、水生动物病害等问题已成为制约水产养殖绿色发展的主要瓶颈[1]。尤其抗生素等药物的大量使用，造成了养殖生物大量药物残留、病原菌耐药性增加、环境污染等严重问题[2]。因此，水产养殖行业急需安全、高效的抗生素替代品[3]。

IgY(immunoglobulin of yolk，IgY)又称卵黄免疫球蛋白，因其具有特异性强、无毒副作用、制备方便、经济优势明显等特点，已被广大研究者所关注。近年来，该技术被广泛用于水产养殖中，以治疗某些水生动物的传染病[4]。IgY技术在预防和治疗水产细菌性方面取得了丰富的进展，如弧菌病、腐皮病、爱德华氏菌病、败血病等。另外，针对水生病毒性疾病如虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)、神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)、弹状病毒(micropterus salmoides rhabdovirus，MSRV)等水生疾病方面也有研究报道。此外，该技术还应用于病原诊断和海鲜保存，丰富了IgY的研究应用。笔者总结了IgY的结构、优势、作用机理等，综述了近年来水产动物病害防治中IgY的应用，以期为IgY在水产动物病害防治中的深入研究和产业化应用提供理论基础。

1 IgY基本特征

1.1 IgY的结构特点IgY分子的结构与动物免疫球蛋白G(IgG)相似，都具有两条重链和两条轻链，且呈Y字形排列。不同之处在于IgG的重链具有3个恒定区，且含有铰链区，而IgY具有4个恒定区。此外，铰链区的缺失使得IgY与IgG的抗原识别和结合能力不同[5]。IgY的等电点为pH 5.7～7.6，比IgG更疏水[5]。IgY的Fc片段与IgG不同，不会激活哺乳动物的补体系统[6]。同样，IgY不与IgA、IgG或类风湿因子结合，从而避免了假阴性或假阳性结果的产生[5]。

1.2 IgY的优势在IgY制备方面，少量的抗原刺激可引起蛋鸡强烈的免疫反应，特异性抗体可以在蛋鸡体内连续合成，抗体产生的周期较长。每枚蛋可收集100～200 mg IgY，成本较低[7]；同时避免了采血对动物的应激反应，符合动物福利的要求[8]。另外，抗体提取方式简单，适合大规模生产，其化学性质稳定，有耐酸、耐碱、耐热的特点[9]。IgY与抗生素相比，IgY具有疗效高、作用快、不易产生耐药菌和继发感染等特点，对病原具有较强的特异性，无毒副作用，具有局部和快速吸收作用及更高的比活性，并且不会有有害物质残留[10]。IgY在对大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[11]、鳗鲡(Anguillajaponica)[12]及中华鳖(Trionyxsinensis)[13]的病原防治过程中，除可有效抑制病原的侵染力外，还具有明显的促生长作用。

2 IgY在水产细菌性疾病中的应用

目前，尽管研究者们开展了一系列研究，但仍尚未完全阐明IgY在疾病的预防和治疗中的作用机制。据已有研究报道，IgY主要通过抑菌活性、凝集作用、黏附抑制、对细菌毒素中和作用，吞噬调理作用方式发挥中和保护效果。

IgY的抑菌活性主要归因于IgY介导的细菌凝集作用[14-15]，细菌与特定IgY形成复合物，并在培养管底部沉淀形成小球，可能导致病原菌活动性下降，降低其自由获取营养的能力，从而发挥抗菌作用[16-17]。有研究表明，特异性IgY以浓度依赖的方式抑制液体培养基中哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)[16]、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)[17]、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)[15]、希瓦氏菌(Shewanellamarisflavi)[14]等的生长。Zhang等[16]通过观察液体培养基浊度来测量特异性IgY对哈维氏弧菌生长的影响，结果显示特异性IgY的浓度越高，作用效果越明显，10 mg/mL特异性IgY的生长抑制作用与0.1 mg/mL链霉素相似(P>0.05)。此外，IgY在固体培养基上也表现出细菌生长抑制作用，说明特异性IgY的抑菌作用不仅有IgY介导的细菌凝集作用，还有一定的拮抗作用[16,18]。Xu等[17]对IgY与迟缓爱德华氏菌相互作用后的反应溶液组分进行分析，发现IgY能使菌体表面变得粗糙，细胞结构发生明显变化，甚至使菌体细胞壁破碎，内容物溢出；MATH试验结果证实，迟缓爱德华氏菌与特异性IgY相互作用后疏水性显著降低17%，表明抗原与IgY结合可以破坏病原体的细胞壁和疏水性，直接阻碍病原体在感染部位的黏附和营养交换，从而还促进吞噬细胞的吞噬作用，降低体内致病性，该结果是对IgY的抑菌机制进一步补充。类似的结果在特异性IgY对希瓦氏菌[14]、灿烂弧菌(Vibriosplendidus)[19]的作用研究中也得到了印证。

此外，体内保护试验显示，特异性IgY能显著降低在半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevi)[20]和香鱼(Plecoglossusaltivelis)[21]血液、肝脏、脾脏和肾脏中鳗弧菌(Vibrioanguillarum)的数量。除降低病原菌数量外，IgY还可以提高血细胞对病原菌的吞噬活性[14,16-17]。特异性IgY可以显著降低大菱鲆脾脏和头肾中促炎细胞因子(IL-1β、IL-8、TNF-α)和补体C3的转录水平，有效缓解迟缓爱德华氏菌引起的炎症反应，有助于避免炎症细胞因子过度产生造成的组织病理学损伤[17]。抗迟缓爱德华氏菌特异性IgY还可以增强大菱鲆(Scophthalmusmaximus)头肾巨噬细胞的吞噬活性，刺激大菱鲆非特异性免疫相关酶(LZM、SOD、POD)的产生，并增强这些酶的活性[22]。

一般来讲，致病菌的蛋白毒素与细胞表面受体结合后内化进入细胞内，才能使细胞发生病变，而IgY与细胞表面受体或毒素蛋白结合，中和这些毒素，并减少毒素蛋白进入细胞来保护细胞的作用。近年来，一种新兴的对虾急性肝胰腺坏死综合征(AHPND)给对虾养殖造成巨大损失。该病原一般为一种携带一个69 kD(pVA1)质粒，可编码PirA、PirB毒力蛋白的一类弧菌[23]。Nakamura等[24]开发了一种基于重组PirA毒素的特异性IgY，将10%高价抗PirA卵黄粉添加到饲料中，投喂3 d后IgY通过特异性结合并中和虾消化系统中释放的天然PirA毒素，与对照组相比，对虾死亡率降低了75%。IgY在水产动物细菌性疾病中的应用见表1。

表1 IgY在水产动物细菌性疾病中的应用

续表1

3 IgY在病毒性疾病中的应用

IgY除了在细菌疾病中的应用外，在病毒疾病方面的防控也得到了广泛的应用。研究发现，IgY可以抑制病毒颗粒的细胞间传播，从而抑制病毒定植。寇海燕等[36]将卵黄粉稀释液与CyHV-2混合后孵育鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)，结果显示CyHV-2病毒解螺旋酶(Hel)基因表达水平分别下调60%，与空白对照组和阴性对照组差异极显著，表明IgY具有较好的病毒中和作用，可显著降低病毒量。一般来讲，采用甲醛灭活完整病毒粒子，可以得到较好的免疫效果IgY[37]。卢亚楠[38]将抗-WSSV特异性卵黄抗体溶于鳌虾饲养水中，结果表明，DNA疫苗特异性IgY组死亡率为80%，灭活WSSV疫苗IgY组死亡率降低至33.3%。从抗原选择上，以DNA疫苗产生的特异性IgY免疫保护效果弱于灭活疫苗。尽管IgY对无脊椎动物不能直接激发其直接病原免疫作用，但可以引发其被动免疫。韦嵩等[39]连续投喂添加抗WSSV-IgY饲料20 d，发现凡纳滨对虾非特异性免疫因子(PO、SOD、ACP、UL)活性均显著高于对照组。袁雪梅等[37]采用MSRV灭活疫苗免疫蛋鸡，获得抗MRSV-IgY，中和作用率达38%以上，病毒核酸拷贝数显著降低，其凝集素在细胞内上调表达，表明其免疫作用被激活。IgY在水产动物病毒性疾病中的应用见表2。

表2 IgY在水产动物病毒性疾病中的应用

4 IgY在水产养殖诊断中的应用

IgY除抑制病原外，还具有病原诊断检测能力。李思泉等[46]采用甲醛灭活柱状黄杆菌免疫蛋鸡获得IgY，建立的间接ELISA方法检测柱状黄杆菌纯培养液的检出限值为1×107cfu/mL，与嗜水气单胞菌、哈维菌无交叉反应，重复性好。另外，王帅兵等[47]以嗜水气单胞菌主要致病因子Aer毒素和胞外蛋白酶(ECPase)作为免疫原制备IgY，与直接用嗜水气单胞菌苗免疫制备的抗体相比，以Aer毒素和ECPase为免疫原获得的抗体与不同来源菌株的致病因子间具有交叉反应性，克服了不同血清型病原菌对IgY免疫保护的影响，具有广泛的适用性。

Young等[48]制备了抗针对太平洋鲑鱼(Oncorhynchusspp.)微孢子虫的特异性IgY。通过间接免疫荧光抗体试验和免疫组化试验检测太平洋鲑鱼各组织的感染。Zhang等[49]应用胶体金与抗全身性败血症球形病毒(STSSSV)特异性IgY结合开发了一种具有高灵敏度和特异性的一步免疫层析条，可在5～10 min内快速检测甲鱼肌肉组织和血清甚至粪便中全身性败血症球形病毒。IgY还能够检测水产品中有害物质。Campora等[50]利用双抗夹心ELISA法检测鱼肉组织中的雪卡毒素，与软海绵酸和软骨藻酸无交叉反应性。

5 存在问题及展望

IgY作为一种安全绿色抗体制剂，被用于检测各种病原体、预防治疗各种疾病，取得了丰富的研究成果及较为理想的应用效果。然而，IgY的研究与应用还存在诸多问题。

首先，IgY对于机体的作用机制并不单一，而是多种作用机制共同作用的的结果，其作用机制仍需进一步深入研究。其次，IgY对革兰氏阴性菌抑制与应用的报道较多，但针对革兰氏阳性菌的研究报道较少，其作用机制还需进一步探索。再次，IgY抑制效果特异性还需要进一步加强，IgY从传统的灭活病原至蛋白水平的特异毒力或结构蛋白为靶蛋白制备手段还需要对病原学进一步的协同，提高其特异性效果。最后，IgY防治技术和产品应用标准化规程尚未建立，使IgY作为水产养殖疾病防治产品而产业化开发具有一定的困难。但随着研究的不断深入，IgY在水产养殖疾病的防治、水产品的保鲜及病害的诊断等方面将有更好的应用前景。