LncRNA LINC00941/miR-597-5p/ARHGEF4分子轴促进神经胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的机制

王媛 洪军 王树伟 王海波 赵迪 张浩良

(1唐山市工人医院神经外科，河北 唐山 063000；2河北医科大学附属第一医院神经外科；3唐山市工人医院肿瘤科)

神经胶质瘤是全球常见的颅内恶性肿瘤之一，严重威胁人类生命健康，其发病率占原发性颅内肿瘤的30%～40%；由于其在颅内呈浸润性生长，导致其癌灶的组织边界并不清晰，其总体预后仍不理想〔1〕。因此，深入研究神经胶质瘤的发病机制，寻找神经胶质瘤有效治疗的新策略是全球亟待解决的关键科学问题。研究表明LncRNA参与调控肿瘤的发生发展过程，且在调控癌相关基因中发挥重要作用〔2〕。以 LncRNA为切入点探索其在神经胶质瘤的发生发展中所扮演的角色，这对于揭示神经胶质瘤的发病机制、寻找肿瘤标志物和药物靶点、判断疾病预后、构建疾病风险评估模型等具有重要意义。研究报道LINC00941定位于12号染色体短臂，LINC00941的表达与胃癌肿瘤的深度和远处转移有关；LINC00941沉默在体外可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并在体内调节肿瘤的生长〔3〕。LINC00941可能是治疗或诊断胃癌的潜在新生物标志物〔4〕。LINC00941还与头颈部鳞状细胞癌的生存时间有关，是具有诊断和预后价值的LncRNA〔5〕。然而LINC00941对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制尚不清楚。结肠癌组织和LoVo细胞中miR-597-5p表达均显著下调，上调其表达可抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭〔6〕。circ-101555可能充当海绵体竞争结合miR-597-5p而促进结直肠癌的进展〔7〕。Rho型鸟嘌呤核苷酸交换因子(RhoGEF)是调节Rho GTPase活性的关键因子，与肿瘤、发育及神经类疾病等有密切关系〔8〕。研究报道Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(ARHGEF)4高表达与腺癌整体生存期较差的独立预测因子相关，并促进胰腺癌细胞侵袭〔9〕。本研究旨在分析LINC00941对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。

1 材料与方法

1.1主要材料 正常的人类神经胶质细胞HEB，胶质瘤细胞系LN18、SW1088、Hs683购自美国模式菌种收集中心(ATCC)；胎牛血清、RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自日本；RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸(BCA)试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒购自上海拜力生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel购自美国BD公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2细胞处理与分组 正常的人类神经胶质细胞HEB和胶质瘤细胞系LN18、SW1088、Hs683用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃、5% CO2条件下培养；取对数生长期细胞LN18，将si-NC、si-LINC00941、pcDNA-NC、pcDNA-LINC00941、miR-NC、miR-597-5p、anti-miR-NC、anti-miR-597-5p、si-ARHGEF4转染至细胞LN18中，分别记为si-NC组、si-LINC00941组、pcDNA-NC组、pcDNA-LINC00941组、miR-NC组、miR-597-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-597-5p组、si-ARHGEF4组；将si-LINC00941分别与anti-miR-NC、anti-miR-597-5p、pcDNA-NC、pcDNA-ARHGEF4共转染至细胞LN18中，记为si-LINC00941+anti-miR-NC组、si-LINC00941+anti-miR-597-5p组、si-LINC00941+pcDNA-NC组、si-LINC00 941+pcDNA-ARHGEF4组。

1.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测LINC00941、miR-597-5p和ARHGEF4 mRNA的表达 提取各组细胞总RNA，反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒说明进行PCR，PCR体系：2 μl反转录产物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μl，7 μl无菌水；反应条件为95℃ 4 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环。相对表达量用2-△△Ct法计算。以GAPDH和U6为内参，LINC00941上游：5′-AGGAGGGCAGGTCAGGTTAT-3′，下游：5′-TTGGGCAACCTAATGAGACC-3′；miR-597-5p上游：5′-TACTTACTCTACGTGTGTG-3′，下游：5′-GACCAGTACTCTACATTACGC-3′；ARHGEF4上游：5′-CCCA GTTGCTCTCACAGTCA-3′，下游：5′-TGTGTCTTCTCCAGCCACAG-3′；GAPDH上游：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′；U6上游：5′-CGCTTCGGCAGCACATA TACTA-3′，下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4Western印迹法检测ARHGEF4、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)2和MMP9蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，BCA试剂盒进行定量。将蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗(1∶2 000)室温孵育90 min，用ECL发光液显影，成像后用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值，以目的条带灰度值和内参β-actin条带灰度值的比值作为蛋白相对表达水平。

1.5MTT检测细胞活性 各组细胞培养48 h后加入20 μl MTT溶液，继续培养4 h，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min使沉淀溶解，用酶标仪检测波长450 nm处吸光度(OD)，以OD表示细胞活性。

1.6Transwell检测细胞迁移和侵袭 细胞侵袭实验：Transwell上室加入100 μl稀释好的基质胶，使其铺满小室，然后在37℃培养箱使其凝固。然后加入100 μl细胞悬液，下室加入500 μl含血清培养液，37℃培养24 h后用0.1%结晶紫染色，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2遍，棉签擦拭掉上层未穿过基底膜的细胞，光学显微镜(×200)下随机选择视野拍照计数。细胞迁移实验：除不用基质胶包被Transwell上室，其余与细胞侵袭实验操作相同。

1.7双荧光素酶报告实验检测LINC00941和miR-597-5p及miR-597-5p和ARHGEF4的靶向关系 构建含有miR-597-5p结合位点的LINC00941和ARHGEF4野生型和突变型荧光素酶报告载体，将其分别与miR-NC和miR-597-5p共转染至LN18细胞中。按照说明书检测荧光素酶活性。

1.8统计学分析 采用SPSS20.0软件行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1在胶质瘤细胞系中LncRNA LINC00941、miR-597-5p、ARHGEF4表达情况 与正常的人类神经胶质细胞HEB相比，胶质瘤细胞系LN18、SW1088、Hs683中LncRNA LINC00941表达水平升高，miR-597-5p表达水平降低，ARHGEF4 mRNA和蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1，图1。

表1 胶质瘤细胞系中LncRNA LINC00941、ARHGEF4和miR-597-5p 表达量

2.2低表达LncRNA LINC00941 对胶质瘤细胞LN18增殖、迁移和侵袭的影响 与si-NC组比较，si-LINC00941组LINC00941、CyclinD1、MMP2和MMP9表达水平细胞活性、细胞迁移和侵袭数量均显著降低(P<0.05)，见表2,图2，图3。

图1 Western印迹检测ARHGEF4蛋白表达

表2 低表达LncRNA LINC00941 对胶质瘤细胞LN18增殖、迁移和侵袭的影响

图2 Transwell检测细胞的迁移和侵袭(结晶紫染色，×400)

2.3高表达miR-597-5p对胶质瘤细胞LN18增殖、迁移和侵袭的影响 与miR-NC组比较，miR-597-5p组miR-597-5p表达水平升高，CyclinD1、MMP2和MMP9表达水平降低，细胞活性降低，细胞迁移和侵袭数量降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4，表3。

2.4低表达ARHGEF4对胶质瘤细胞LN18增殖、迁移和侵袭的影响 与si-NC组比较，si-ARHGEF4组ARHGEF4、CyclinD1、MMP2和MMP9表达水平降低，细胞活性降低，细胞迁移和侵袭数量降低(P<0.05)，见表4，图5。

图3 Western印迹检测两组CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达

图4 Western印迹检测两组CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达

2.5LncRNA LINC00941靶向miR-597-5p，miR-597-5p靶向ARHGEF4 LncBase Predicted v.2在线软件预测显示，miR-597-5p 和LncRNA LINC00941存在互补的结合位点(图6A)；TargetScan在线软件预测显示，ARHGEF4和miR-597-5p 存在互补的结合位点(图6B)。

表3 高表达miR-597-5p对胶质瘤细胞LN18增殖、迁移和侵袭的影响

表4 低表达ARHGEF4对胶质瘤细胞LN18增殖、迁移和侵袭的影响

图5 Western印迹检测两组ARHGEF4、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达

双荧光素酶报告实验结果显示，miR-NC或miR-597-5p与LINC00941、ARHGEF4野生型及突变型报告质粒共转染LN18细胞后，与miR-NC组(1.00±0.10、1.00±0.08)相比，miR-597-5p组转染LINC00941、ARHGEF4野生型的细胞荧光素酶活性(0.42±0.04、0.46±0.04)显著降低(均t=16.155、18.112，均P=0.000)；而转染突变型的细胞荧光素酶活性(1.01±0.11 vs 0.98±0.09;1.02±0.10 vs 0.98±0.08)无显著变化(t=0.633、0.937，P=0.536、0.363)。与pcDNA-NC组(1.00±0.10)相比，pcDNA-LINC00941组miR-597-5p表达水平(0.43±0.04)显著降低，与si-NC组(1.01±0.09)相比，si-LINC00941组miR-597-5p表达水平(1.32±0.11)显著升高(P<0.05)。与miR-NC组(0.84±0.08)相比，miR-597-5p组ARHGEF4蛋白表达水平(0.43±0.04)显著降低，与anti-miR-NC组(0.85±0.07)相比，anti-miR-597-5p组ARHGEF4蛋白表达水平(1.12±0.11)显著升高(P<0.05)。

2.6下调miR-597-5p能够逆转LINC00941低表达对LN18细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与si-LINC00941+anti-miR-NC组比较，si-LINC00941+anti-miR-597-5p组miR-597-5p表达水平降低，CyclinD1、MMP2和MMP9表达水平升高，细胞活性升高，迁移、侵袭细胞数升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图7，表5。

A：LncBase Predicted v.2对miR-597-5p 和LncRNA LINC00941结合进行预测示意图，B：TargetScan对ARHGEF4和miR-597-5p 结合进行预测示意图，C：Western印迹检测ARHGEF4蛋白表达图6 LncRNA LINC00941靶向miR-597-5p，miR-597-5p 靶向ARHGEF4

1～2，si-LINC00941+anti-miR-NC组,si-LINC00941+anti-miR-597-5p组图7 Western印迹检测CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达

2.7上调ARHGEF4能够逆转LINC00941低表达对LN18细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与si-LINC00941+pcDNA-NC组比较，si-LINC00941+pcDNA-ARHGEF4组ARHGEF4、CyclinD1、MMP2和MMP9表达水平、细胞活性、迁移、侵袭细胞数均显著升高(P<0.05)，见表6，图8。

表5 下调miR-597-5p 能够逆转LINC00941低表达对LN18细胞增殖、迁移和侵袭的影响

表6 上调ARHGEF4能够逆转LINC00941低表达对LN18细胞增殖、迁移和侵袭的影响

1～2:si-LINC00941+pcDNA-NC组、si-LINC00941+pcDNA-ARHGEF4组图8 上调ARHGEF4能够逆转LINC00941低表达对LN18细胞增殖、迁移和侵袭的影响

3 讨 论

神经胶质瘤发病率高、侵袭性强、预后差，中位无进展生存期及中位总生存期较短；随着科研的发展，一些新兴靶向抗肿瘤药物应运而生，给神经胶质瘤的医治带来了新希望〔10〕。研究表明LncRNA与肿瘤的进展密切相关，如肺腺癌患者存活率降低与LINC00941高表达有关〔11〕。结直肠癌组织中LINC00941 RNA的表达水平显著高于癌旁组织，干扰LINC00941表达可降低结直肠癌HCT116细胞增殖速度〔12〕。本实验结果表明LINC00941或可能与胶质瘤有关。本实验进一步转染LINC00941干扰表达载体，表明LINC00941低表达可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭。

有研究报道miR-597-5p在HPV16阳性子宫颈癌中差异表达〔13〕。miR-597-5p与胃癌的转移和侵袭相关〔14〕。本实验结果显示，miR-597-5p在胶质瘤细胞系中低表达，高表达可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭。下调miR-597-5p能逆转LINC00941低表达对LN18细胞增殖、迁移和侵袭的影响。本实验通过Targetscan预测显示miR-597-5p与ARHGEF4具有结合位点，且双荧光素酶实验证实miR-597-5p可靶向调控ARHGEF4。研究报道靶向ARHGEF4的小干扰RNA有效传递到胰腺癌细胞中可抑制胰腺肿瘤的侵袭和转移〔15〕。本实验结果显示，胶质瘤细胞系中ARHGEF4高表达，低表达ARHGEF4可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭。且本实验还发现上调ARHGEF4均能逆转LINC00941低表达对LN18细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

综上，LncRNA LINC00941下调表达可能通过miR-597-5p/ARHGEF4分子轴抑制神经胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭。为以LncRNA LINC00941及其互作分子作为胶质母细胞瘤诊断标准和治疗靶点及胶质母细胞瘤靶向药物的研发提供新思路。