基于信息熵赋权法和正交试验优选乌头桂枝汤提取工艺*

盛竹君，杨满琴，高玉菊，杨晓丹，胡 蝶，徐维平

（1.安徽省针灸医院，安徽 合肥 230061；2.安徽省立医院，安徽 合肥 230002）

乌头桂枝汤出自《金匮要略》，由制川乌、桂枝、白芍、炙甘草、生姜和大枣组方。方中，川乌具有祛风除湿、镇痛、抗炎、增强免疫等作用[1-3］；桂枝具有解热、镇痛、抗炎、抗菌、扩血管、调节免疫等作用[4-6］；白芍具有抗炎、镇痛、养血等药理作用，用于调节免疫和治疗风湿免疫疾病等[7-8］；炙甘草具有止痛、补脾益气、调和诸药等功效[9］。乌头桂枝汤镇痛抗炎作用明显，是治疗各种痹症的代表方剂[10-11］。由于中药汤剂成分复杂，有效成分较多，采用单一指标评价具有片面性。查阅文献和《中国药典》可确定汤剂中多个有效成分作为评价指标，通常由主观赋权法或客观赋权法获得综合评价指标，进而优选中药汤剂制备工艺。主观赋权法是根据研究者主观意愿赋予权重系数，受主观意识影响较大，具有一定局限性；客观赋权法是基于矩阵的方法，对多个有效指标数据进行整理，计算出权重系数（Wi）。熵起源于热力学，是热能的变化量与温度的比值，广泛应用于工程技术及经济社会。信息熵（Hi）是信号集的平均信息量，度量系统的不确定性和无序性，广泛用于多指标评价[12］。本研究中以芍药苷、桂皮醛、甘草苷、甘草酸单铵盐、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰乌头原碱含量为评价指标，采用信息熵赋权法将多项评价指标转换成单一评价指标，并利用正交试验优选汤剂提取工艺。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司），配有2966型二极管阵列检测器、Empower3色谱工作站；BSA124S型赛多利斯电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，精度为万分之一）。

1.2 试药

芍药苷对照品（批号为AF9030313），桂皮醛对照品（批号为20051753），甘草苷对照品（批号为AF20071952），甘草酸单铵盐对照品（批号为AF20031131），苯甲酰新乌头原碱对照品（批号为AF8052807），苯甲酰次乌头原碱对照品（批号为AF9112602），苯甲酰乌头原碱对照品（批号为AF20033001），均购于成都埃法生物科技有限公司，采用面积归一化法检测的纯度均大于98%；乙腈（色谱纯，成都市诺尔施科技有限责任公司）；三乙胺（分析纯，上海易恩化学技术有限公司）；磷酸（分析纯，科隆化学品有限公司）；水为怡宝纯净水；制川乌（批号为356391），桂枝（批号为357151），白芍（批号为357158），炙甘草（批号为357359），生姜（批号为357601），大枣（批号为356516），均购于亳州市沪谯药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Ultimate LP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为磷酸+三乙胺混合溶液（0.5 mL磷酸和0.5 mL三乙胺，pH 6.5），梯度洗脱（0～30 min时20%A→60%A，30～31 min时60%A→80%A，31～35 min时80%A，35～36 min时80%A→20%A，36～45 min时20%A）；检测波长：230 nm（芍药苷、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰乌头原碱），237 nm（甘草苷），290 nm（桂皮醛），254 nm（甘草酸单铵盐）；柱温：35℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10µL。

2.1.2 溶液制备

精密称取芍药苷13.5 mg，用甲醇溶解定量至25 mL，精密称取桂皮醛15.5 mg，用甲醇溶解定量至25 mL，精密称取甘草苷13 mg，用甲醇溶解定量至25 mL；精密称取甘草酸单铵盐10.8 mg，用甲醇溶解定量至10 mL；精密称取苯甲酰新乌头原碱8 mg，用甲醇溶解定量至200 mL，精密称取苯甲酰次乌头原碱9.2 mg，用甲醇溶解定量至200 mL，精密称取苯甲酰乌头原碱3.2 mg，用甲醇溶解定量至200 mL，分别配制终质量浓度为0.540，0.620，0.520，1.080，0.040，0.046，0.016 mg/mL的对照品溶液。

精密称取芍药苷1.1 mg，桂皮醛1.0 mg，甘草苷0.8 mg，甘草酸单铵盐1.0 mg，苯甲酰新乌头原碱0.9 mg，苯甲酰次乌头原碱0.6 mg和苯甲酰乌头原碱0.6 mg，用甲醇溶解定量至10 mL，配制成混合对照品溶液。

取制川乌20 g，桂枝12 g，白芍9 g，炙甘草6 g，生姜9 g，大枣9枚，置圆底烧瓶中，加水浸泡后煎煮，取煎煮液定容至1 000 mL。取样品5 mL，45℃水浴超声10 min，混匀，放冷，0.45µm针头滤器滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取2.1.2项下对照品溶液10µL，按2.1.1项下色谱条件进样测定。以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X，µg/mL）为横坐标进行线性回归，结果见表1。以待测成分响应值分别为3倍和10倍信噪比（S/N）时的质量浓度为检测限和定量限。结果见表1。

表1 线性关系考察与检测限、定量限确定结果Tab.1 Results of the linear relation test，LOD and LOQ

2.2 提取工艺优化

2.2.1 正交试验设计与结果

以药物浸泡时间（A）、提取时间（B）、加水量（C）为影响因素，每个因素选取3个水平，以芍药苷、甘草苷、甘草酸单铵盐、单酯型生物碱、桂皮醛含量为评价指标，其中单酯型生物碱以苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的总含量计，进行L9（34）正交试验[13］。因素与水平见表2，试验设计与结果见表3。

表2 因素与水平Tab.2 Factors and their levels

2.2.2 信息熵赋权法确定Wi

1）构建原始评价指标矩阵（Xij）mn

2）将（Xij）mn转化为概率矩阵（Pij）mn

5）计算综合评分（Mm）

由表3和公式计算结果可知，当Hi越小、Wi越大时，评价指标在综合评价中作用力度越大；反之，越小。芍药苷、甘草苷、单酯型生物碱、甘草酸单铵盐与桂皮醛的Hi分别为0.991 7，0.998 5，0.968 3，0.986 1，0.963 8，Wi分别为0.090 6，0.016 4，0.346 1，0.151 7，0.395 2。可见，桂皮醛含量的Hi小、Wi大，在不同试验条件下变化最显著，在综合评价中作用力度最大；甘草苷含量则相反。

2.2.3 方差分析

由表3可知，各因素对乌头桂枝汤综合评分的影响主次顺序为提取时间＞浸泡时间＞加水量。乌头桂枝汤提取最优工艺为A2B2C2，即加10倍量水浸泡1.0 h，提取1.0 h。采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行方差分析，结果见表4。可见，提取时间有统计学意义（P＜0.05），浸泡时间和加水量均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 L9（34）正交试验设计与结果Tab.3 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表4 方差分析结果Tab.4 Results of the ANOVA

2.3 验证试验

按优选最佳工艺提取3批乌头桂枝汤进行验证试验，结果见表5。可见，提取工艺、数据评价方法具有可行性。

表5 验证试验结果Tab.5 Results of the verification test

3 讨论

3.1 评价指标选择

参考2020年版《中国药典（一部）》，本研究中以白芍中芍药苷，制川乌中苯甲酰新乌头原碱，苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱，桂枝中桂皮醛[14］288，炙甘草中甘草苷[14］89和甘草酸单铵盐[14］200为评价指标。制川乌毒性较大，煎煮后由毒性较高的双酯型生物碱水解成毒性较低的单酯型生物碱[15］。苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱是制川乌中的单酯型生物碱，具有镇痛、抗炎、抗肿瘤等作用[16-17］。芍药苷具有抗炎、增强免疫力、抗氧化等药理作用[18］。桂皮醛具有抗肿瘤、抗糖尿病、抗炎等药理作用[19］。甘草苷具有抗凋亡、抗炎、降糖、调脂等药理作用[20］。甘草酸单铵盐具有良好的抗炎与抗肿瘤等药理作用[21］。本研究中并未评价乌头桂枝汤在基础研究中的其他活性物质，所选评价指标不能全面优选提取工艺。

3.2 检测波长选择

芍药苷、桂皮醛、甘草苷、甘草酸单铵盐、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰乌头原碱的混合对照品溶液在200～800 nm范围内进行全波长扫描，检测波长为各有效成分的最大吸收波长，可确保检测方法的正确性。

3.3 正交试验设计

正交试验利用“均匀分散”挑选在考察范围内的少量试验点，以及应用“整齐可比”更方便分析试验结果，找出最佳制备工艺。为了保证试验结果的“整齐可比”，需要较多的试验点。运用正交试验[22-23］优化乌头桂枝汤提取工艺，考察浸泡时间、提取时间、加水量三因素三水平。在乌头桂枝汤的优化工艺中，需兼顾多个有效成分作为评价指标，具有复杂性和难度性。

3.4 信息熵赋权法

Hi是不确定性和无序性的一种量度，熵权法以Hi为理论依据，对多种指标评价赋权，得出综合评分，可作为多指标数据评价的理论依据[24］。在药物多个效应评价的试验中，将多个效应评价指标通过信息熵理论进行客观赋权，建立综合效应评价指标，综合效应评价指标可清晰反映药物剂量对多个效应评价指标的整体影响，避免各个效应评价指标的互相影响，提升了试验多评价指标数据处理的科学性和严谨性[25］。

3.5 评价指标处理

中药汤剂成分复杂，有效成分较多，本研究中通过查阅文献和药典确定汤剂中多个有效成分为评价指标，Wi是汤剂优选工艺多指标评价的关键。采用信息熵赋权法计算各指标含量的Wi，将多项评价指标转换成单一评价指标。但单纯使用客观赋权法也有一定局限性，可能会造成中药复方的主要成分权重过低或次要成分权重过高。故在实际操作中还应根据具体研究确定是否和主观赋权法联用。