UPLC-MS/MS法同时测定小活络丸中3种功效成分和3种毒性成分

钱 岩， 顾臣贤， 吴 杨， 王天宇， 李华露， 闵春艳*

(1.苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215104；2.苏州大学，江苏 苏州 215006；3.南京中医药大学，江苏 南京 210046)

小活络丸是一种传统中药制剂，来源于《太平惠民和剂局方》中的活络丹，由胆南星、制川乌、制草乌、地龙、乳香(制)、没药(制)6味中药制成，具有祛风散寒、化痰除湿、活血止痛的功效，用于治疗风寒湿邪闭阻、痰瘀阻络所致肢体关节疼痛、关节屈伸不利、麻木拘挛等病症[1-5]。课题组前期对不同厂家多批次小活络丸开展质量评价，发现部分样品中的君药制川乌、制草乌存在掺伪投料问题，势必导致该制剂主要功效成分含量降低，从而影响药效。

目前，对小活络丸中乌头类生物碱成分含量测定仅有少量报道[6-11]。因此，本实验首次采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱(UPLC-MS/MS)法同时测定该制剂中功效成分苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱，以及毒性成分乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的含量[12-15]，该方法具有更高的选择性、专属性、灵敏度，并且样品处理简便快捷，可从有效性、安全性2个角度对其进行质量控制。

1 材料

Waters Acquity UPLC(配置二元泵系统、自动进样器)、Waters Xevo TQ-S 质谱仪(电喷雾离子源，正离子模式)、MassLynx 4.1工作站(美国Waters公司)；Acquity BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；XP56 电子天平(精度0.001 mg)、XSE205DU电子天平(精度0.01 mg)(瑞士Mettler-Toledo公司)；SK5200HP超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司)；Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)。

苯甲酰乌头原碱(批号111794-200901，纯度98.6%)、苯甲酰次乌头原碱(批号111796-200901，纯度99.5%)、苯甲酰新乌头原碱(批号111795-200901，纯度99.6%)、乌头碱(批号110720-200410)、次乌头碱(批号110798-200805，纯度99.5%)、新乌头碱(批号110799-200505)对照品均购自中国食品药品检定研究院；16批小活络丸购自各大药房，来源于厂家A～N，批号分别为20180504、170110、180010、20181001、180101、180005、180006、181001、20180601、4940003、20170101、180402、20180118、007808、180903、1704132。乙腈为色谱纯；甲酸为分析纯(体积分数98%～100%)；水为超纯水(由Milli-Q纯水仪制备)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Acquity BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～2 min，23%～25%A；2～7 min，25%A；7～8 min，25%～95%A；8～11 min，95%A；11～12 min，95%～23%A)；体积流量0.4 mL/min；柱温30 ℃；进样量2 μL。

2.2 质谱条件 Xevo TQ-S MS/MS系统；电喷雾离子源，正离子检测(ESI+)；离子源温度150 ℃；毛细管电压2.5 kV；去溶剂气温度650 ℃，体积流量650 L/h；锥孔气体积流量160 L/h；喷雾器气流5 bar(1 bar=100 kPa)；多反应监测(MRM)模式，其他质谱参数[16]见表1。

表1 各乌头生物碱质谱参数

2.3 对照品溶液制备 精密称取对照品苯甲酰乌头原碱2.323 mg、苯甲酰次乌头原碱2.063 mg、苯甲酰新乌头原碱2.320 mg、乌头碱2.807 mg、次乌头碱2.075 mg、新乌头碱1.865 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 供试品溶液制备 精密称取本品9 g，剪碎，精密加入4.5 g硅藻土，混合研细，取约3 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，称定质量，超声处理30 min(温度控制在25 ℃以下)，甲醇补足减失的质量，摇匀，离心，取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液Ⅰ，用于测定乌头碱、次乌头碱、新乌头碱含量。精密量取1 mL，置于100 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液Ⅱ，用于测定苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱含量。

2.5 阴性样品溶液制备 取胆南星18 g、地龙18 g、乳香6.6 g、没药6.6 g，粉碎成细粉，过筛，混匀，加入60 g炼蜜制成大蜜丸，每丸3 g，作为阴性样品，按“2.4”项下方法制备，即得。

2.6 专属性考察 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，结果见图1～3。由此可知，阴性样品溶液中未出现与供试品溶液中对应成分保留时间一致的色谱峰，表明它对检测无干扰，该方法专属性良好。

2.7 线性关系考察 精密量取对照品溶液适量，甲醇稀释成系列质量浓度，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，再以信噪比(S/N)约为10时测定定量限，约为3时测定检测限，结果见表2，可知各乌头生物碱在各自范围内线性关系良好。

表2 各乌头生物碱线性关系

2.8 精密度试验 取对照品溶液(苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱质量浓度分别为0.035、0.031、0.035、0.042、0.031、0.028 ng/mL)适量，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定6次，测得苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰面积RSD分别为1.15%、1.86%、2.42%、0.89%、1.35%、1.45%，表明仪器精密度良好。

2.9 稳定性试验 取本品适量，按“2.4”项下方法制备供试品溶液Ⅰ、Ⅱ，取两者与对照品溶液(乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱质量浓度分别为132.781、99.072、88.672、103.096、96.017、100.208 ng/mL)适量，于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得供试品溶液Ⅰ中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰面积RSD分别为1.71%、2.07%、3.29%，供试品溶液Ⅱ中苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱峰面积RSD分别为1.55%、1.34%、1.46%，对照品溶液中苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰面积RSD分别为0.51%、0.58%、0.68%、1.10%、0.86%、0.87%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.10 重复性试验 精密称取同一批本品6份，按“2.4”项下方法制备供试品溶液Ⅰ、Ⅱ，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱含量RSD分别为1.10%、1.05%、5.25%、2.69%、2.46%、2.84%，表明该方法重复性良好。

2.11 加样回收率试验 精密称取“2.4”项下细粉1.5 g，共9份，分别按50%、100%、150%水平精密加入50 mL对照品溶液，按“2.4”项下方法制备供试品溶液Ⅰ、Ⅱ，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，计算回收率。结果，乌头碱平均加样回收率为102.14%，RSD为5.75%；次乌头碱平均加样回收率为100.65%，RSD为2.98%；新乌头碱平均加样回收率为98.33%，RSD为7.88%；苯甲酰乌头原碱平均加样回收率为101.30%，RSD为5.00%；苯甲酰次乌头原碱平均加样回收率为101.90，RSD为4.07%；苯甲酰新乌头原碱平均加样回收率为100.80%，RSD为4.47%。

2.12 样品含量测定

取16批样品，按“2.4”项下方法制备供试品溶液Ⅰ，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，结果见表3、图4A，可知乌头碱含量分布范围为(0.574±0.490)μg/g，即0.084～1.064 μg/g，有3批(T8、T9、T10)在此范围外。根据2020年版《中国药典》一部小活络丸乌头碱限量，折算出乌头碱限度为不得超过30 μg/g，表明上述样品均未超标。

2020年版《中国药典》一部制川乌和制草乌项下规定，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱总含量不得超过0.040%，结合小活络丸处方，折算出该制剂中三者总含量应不得超过75 μg/g，16批样品均未超标。图4B显示，上述3种成分总含量分布范围为(7.216±7.441)μg/g，即0～14.657 μg/g，有2批(T10、T11)在此范围外，总体上较安全。

取16批样品，按“2.4”项下方法制备供试品溶液Ⅱ，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，结果见表3。2020年版《中国药典》一部制川乌项下规定，苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱总含量应在0.070%～0.15%范围内；制草乌项下规定，上述3种成分总含量应在0.020%～0.070%范围内，参照两者限度值(取0.020%～0.15%)，结合小活络丸中制川乌、制草乌处方量，推算该制剂中三者总含量应在37～280 μg/g范围内。图4C显示，苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱总含量分布范围为(175.75±93.579)μg/g，即82.171～269.329 μg/g，有2批(T4、T14)在此范围外且超出拟定限度，即有14批分布较集中。

表3 各乌头生物碱含量测定结果(μg/g)

3 讨论

结果显示，16批小活络丸中乌头碱含量及乌头碱、次乌头碱、新乌头碱总含量均符合拟定标准限度，但有2批样品中苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱总含量超过上限值；14批样品中功效成分、毒性成分含量均相对集中，表现出较好的质量均一性。但本实验设定的小活络丸功效成分含量限度范围较大，是否合理尚不明确，需要临床实践和药理学、毒理学研究的进一步支持。

另外，除T14外，有药材掺伪的样品(T11～T13、T15～T16)中功效成分含量均在拟定限度范围内，推断上述现象无严重影响，但若其含量超过上限值，则厂家应注意制川乌、制草乌质量及生产工艺的控制。对于小活络丸这种所含毒性成分也是有效成分的中药制剂而言，应结合服用量、处方配伍、治疗疗程、传统经验，利用现代分析技术建立更科学合理的质量控制标准，规范该制剂质量，从而保证其临床用药的安全有效。