利胆清胰解毒汤对急性胆源性胰腺炎大鼠炎症因子、肠道屏障功能及TRPV1、CGRP表达的影响

林 晓，骆超风，顾园龙

(1浙江中医药大学·浙江 杭州 310053；2台州市中西医结合医院·浙江 台州 317523；3台州市立医院·浙江 台州 317700)

利胆清胰解毒汤是台州市中西医结合医院自拟协定处方，具有疏肝利胆、活血止痛、清热解毒之功效，用于治疗急性胆源性胰腺炎(acute biliary pancreatitis, ABP)疗效显著[1]。本研究通过建立急性胆源性胰腺炎大鼠模型，采用利胆清胰解毒汤干预，旨在探讨利胆清胰解毒汤对ABP模型大鼠炎症因子、肠道屏障功能及TRPV1、CGRP表达的影响，为临床用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 50只清洁级健康雄性SD大鼠，7～8周龄，平均体质量(250±20)g，由北京维通利华公司提供，动物许可证号 SCXK(京)2017-0004，室温20～25 ℃、相对湿度40%～50%下饲养，通风环境良好，自由饮水进食。

1.2 药物与试剂 利胆清胰解毒汤组成：金钱草、蒲公英30 g，木香、大黄各20 g，柴胡、青皮各12 g，黄芩、枳壳、郁金各9 g，栀子15 g，黄连10 g；饮片均由台州市中西医结合医院医院药房提供，并经浙江中医药大学张冰教授鉴定为正品。药材加水煎煮2次，浓缩至含生药浓度1 g/mL。奥曲肽：北京双鹭药业有限公司，批准文号：国药准字H20020229，规格：1 mL：0.1 mg。兔 TRPV1 抗体：Abcam 公司，批号：ab7247；山羊CGRP抗体：Abcam 公司，批号：ab41107；水合氯醛(分析纯)：天津市瑞金特化学品有限公司；HE染色液：Sigma公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)和白介素-1β(IL-1β)检测试剂盒：武汉博士德生物技术有限公司；内毒素(ET)、D-乳酸(DLA)、二胺氧化酶(DAO)以及淀粉酶(AMY)检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器 AU5821全自动生化分析仪：贝克曼库尔特公司；LDZ-2 型低速离心机：北京京立离心机有限公司；电子天平：瑞士梅特勒公司；超低温冰箱：合肥美菱股份有限公司；Multiskan MK3型酶标仪：Thermo Scientific公司；SelectCycler II多通道PCR 扩增仪：广州菲罗门科学仪器有限公司；Bio-Rad电泳仪：美国伯乐公司；Cleaver凝胶成像系统：英国Cleaver 公司；BX53 光学显微镜：日本Olympus公司。

1.4 动物分组、造模与给药 50只SD大鼠 随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组(奥曲肽)、利胆清胰解毒汤低剂量组及高剂量组，每组10只。参照文献[2]进行造模。除正常组外，其余各组采用胆胰管结扎术，即在术前30 min给予100 μmol/kg TRPV1拮抗剂腹腔注射进行预处理，然后在胆胰管共开口十二指肠壁缝合结扎，术后3 h进行评估。造模成功后，正常组和模型组给予等剂量生理盐水灌胃；阳性组给予50 μg/kg奥曲肽；低剂量组给予 7.2 g/kg利胆清胰解毒汤，高剂量组给予 21.6 g/kg利胆清胰解毒汤；1次/ 天，周期7 d。

1.5 观察指标

1.5.1 血清炎症因子检测 末次给药后12 h,腹主动脉采血5 mL，离心，分离血清，ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、IL-10及IL-1β水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.5.2 肠道屏障功能检测 腹主动脉采血5 mL，离心，分离血清，采用鲎试剂酶反应显色法检测血清内毒素(ET)含量，采用酶学分光光度法检测D-乳酸(DLA)含量,采用双抗体夹心法检测二胺氧化酶(DAO)含量，采用EPS-G7底物法检测淀粉酶(AMY)含量。

1.5.3 胰腺组织病理学变化观察 采血后处死大鼠后，取病变胰腺组织，生理盐水清洗后，10%甲醛固定、二甲苯脱脂，酒精脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察大鼠的胰腺病理组织学改变情况。大鼠胰腺病理组织评分参照 Amy法[3]，采用0～10 分制对大鼠的胰腺组织的水肿、炎症、出血、坏死程度进行盲法评分。

1.5.4 胰腺组织TRPV1、CGRP mRNA表达 采用Real-time PCR检测大鼠胰腺组织 TRPV1、CGRP mRNA 表达。以R-GAPDH为内参基因。具体步骤：提取胰腺组织总RNA，BCA 法测定蛋白浓度，Primer5.0 软件设计引物，进行SDS-PAGE 电泳，转膜，封闭、加入一抗、二抗，显色。凝胶图像分析，使用Gel-Pro Analyzer 4.0软件分析结果灰度。计算TRPV1、CGRP相对mRNA 表达水平。其中引物TRPV1 上游5’-CTCCTGACGGCAAGGATGAC-3’、下游 5 ’-AGTTGCCTGGGTCCTCGTT-3’，扩增片段105bp；引物CGRP上游5’-TGGTTGTCAGCATCTTGCTCC-3’，下游5 ’ - CACTGAGAGTGGCCATGCCT-3’， 扩增片段99 bp。以GAPDH为内参，计算TRPV1、CGRP蛋白的相对表达水平(p)。

2 结果

2.1 各组大鼠血清炎症因子含量比较 见表1。

表1 各组大鼠血清炎症因子含量比较

2.2 各组大鼠肠道屏障功能比较 见表2。

表2 各组大鼠肠道屏障功能指标比较

2.3 各组大鼠胰腺组织病理学变化观察结果 正常对照组大鼠胰腺小叶、腺体和胰岛结构清晰。模型组大鼠胰腺腺体坏死，结构不清，小叶间隙明显增宽，炎症细胞浸润，间质内可见出血、小血管坏死。阳性对照组、利胆清胰解毒汤低剂量组及高剂量组大鼠胰腺腺体坏死明显减轻，小叶间隙明显变窄，炎症细胞浸润明显减轻，高剂量组大鼠的胰腺改变尤其明显。见图1。各组大鼠胰腺病理变化评分见表3。

图1 各组大鼠的胰腺组织病理变化(HE，×100)

表3 各组大鼠胰腺组织病理评分比较

2.4 各组大鼠胰腺组织TRPV1、CGRP表达的RT-PCR检测结果 见图2，表4。

图2 各组大鼠胰腺组织TRPV1、CGRP、电泳图

表4 各组大鼠胰腺组织TRPV1、CGRP表达比较

3 讨论

急性胆源性胰腺炎(acute biliary pancreatitis, ABP)是指胆道系统炎症、结石或胆管结构异常等各种胆管疾病所导致的急性胰腺炎，其发病急促，进展迅速，如治疗不及时，可致感染、休克甚至死亡。ABP是急性胰腺炎中最常见类型，约占60%，其发病机制与结石活动密切相关[4]。目前医学界认为继发炎症因子异常释放和肠道屏障功能损伤在ABP进展过程中起重要作用[5]。西医治疗以抑抑制胰蛋白酶消化、抗感染及抑制胃酸分泌等药物为主，虽有一定的临床效果，但胰腺功能损伤难以减轻，远期预后改善效果欠佳。中医学认为，ABP病因为脾胃失常，阴津耗灼，热毒内蕴，内陷心包所致[6]，治疗宜利胆解毒。

研究发现，ABP患者起病时，TNF-α、IL-6 以及IL-1β水平即出现异常[7]。TNF-α是ABP炎症反应最重要始动细胞因子之一，可预测病情严重程度；降低IL-6和IL-1β水平可减轻发病ABP患者的胰腺组织及周围脏器损伤[8]。IL-10水平可敏感反映ABP患者机体免疫系统功能[9]。肠道黏膜屏障功能是反应急性胰腺炎发生级联反应的关键，其有效指标为ET、DLA、DAO以及AMY；其中ET与肠壁血管通透性密切相关，当肠道屏障功能受损时，细胞发酵的代谢产物DLA可大量入血，加速肠道受损程度[10-11]；肠道机械屏障完整性与DAO密切相关[12]；AMY可作为早期急性胰腺炎诊断的有效指标[13]。急性胰腺炎发病过程中TRPV1、CGRP起着关键作用。TRPV1主要分布于肽能神经元中，是负责传递热伤害感受，激活后引发细胞外钙内流，促发或调控多种细胞内事件。TRPV1参与胰腺感觉神经元的敏化和神经源性炎症的发生，在胰腺炎内脏疼痛和痛觉过敏发病机理中至关重要[14]。CGRP是重要的具有负向调节功能的免疫调节肽，维持机体内环境平衡。CGRP参与急性胰腺炎的疼痛、炎症等病理过程同时，还防止致炎因子对神经元的造成损伤[15]。研究发现，TRPV1、CGRP表达与胰腺炎病理改变呈正相关[16]。奥曲肽为一种人工合成八肽环状化合物，具有与天然内源性生长抑素的作用，但作用较强且持久，可明显抑制胃肠道和胰内激素的病理性分泌过多，降低胃肠道运动和胆囊排空，对胰腺实质细胞有直接保护作用[17]。

中医认为ABP属“胃心痛” “脾心痛”“腹痛”等范畴。郁、毒、热、瘀互结是其病因病机[18]，故治疗应以疏肝解郁、活血化瘀、清热解毒为主。利胆清胰解毒汤具有疏肝利胆、活血化瘀止痛、清热解毒之功效。其中柴胡疏肝解郁；金钱草利胆排石；大黄活血化瘀，泄阳明腑实热；木香、青皮、枳壳行气止痛、健脾消食，助柴胡疏肝理气，调理气机；郁金活血凉血止痛，行气解郁，利胆退黄，助金钱草排石；栀子清三焦之热，凉血解毒；黄芩、蒲公英、黄连清热解毒；诸药合用，以达到疏肝利胆、活血化瘀、行气止痛、清热解毒之功效。现代药理研究发现，柴胡、黄芩以及大黄可明显减少胃液和胰液的分泌量，促进胰腺恢复，其主要作用于 PTGS2、DPP4、PRSS1、RELA、VEGFA 等靶点[19-22]；金钱草具有较强排石作用，并有抗菌、镇痛功效[23]；青皮、枳壳可促进胆汁分泌、同时具有抗炎、镇痛功效，并保护肝细胞[24]；蒲公英、黄连、木香以及郁金具有广谱的抗菌、抗炎作用，消除体内内毒素[25-26]。

本文结果显示：利胆清胰解毒汤可有效降低急性胆源性胰腺炎模型大鼠血清炎症因子水平，增强肠道屏障功能，减轻胰脏组织损伤，减少胰腺组织TRPV1、CGRP表达；对治疗急性胆源性胰腺炎具有较高的临床应用价值，其他作用机制仍需要进一步探讨。