Notch信号通路与不明原因复发性流产的相关性

柳倩，潘丁晨，杜乐，黄河，蒋国静*

复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指女性跟同一性伴侣，在妊娠28周以内出现两次或两次以上的妊娠丢失，妊娠终止时胎儿体重不足1 000 g[1]。欧洲人类生殖和胚胎学学会认为，临床若发生两次妊娠丢失即要考虑诊断为RSA，其会影响1%～2%夫妇的生殖健康[2]，已知的病因包括血栓形成倾向、内分泌代谢紊乱、解剖结构异常，以及免疫、遗传、不良生活方式等[3]，除以上外仍无法找到病因的患者属于不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。一项研究调查了2011年1月至2017年8月就诊于哥伦比亚妇女医院的RSA患者，发现URSA患者约占40%～50%[4]。Notch信号通路属于进化保守的细胞间信号转导机制，参与生长发育和细胞的分化、增殖、凋亡等[5]。Notch信号通路通过介导内皮细胞和壁细胞(又称周细胞)形成，维持血管系统[6]，调节胚胎滋养层侵袭母体子宫组织[7]，促进子宫内膜蜕膜化[8]，在母胎界面滋养层侵袭与螺旋动脉重塑方面尤为显著，与URSA等病理妊娠状态密切相关。

1 Notch信号通路

Notch家族包括Notch(1～4)四种受体以及五种配体：Delta样配体(DLL1、3、4)和锯齿样配体(Jagged1、2)[9]。其中，Notch1、2参与生长发育过程，而Notch3、4广泛表达于血管系统的细胞亚群中，包括平滑肌细胞和内皮细胞[10]。Notch受体前体在内质网和高尔基体中经历广泛的翻译和修饰[11]，成熟后成为细胞表面的跨膜受体。Notch1～Notch4信号转导途径基本一致，但靶基因和效应蛋白不尽相同，经典基因靶点有分裂增强子(HES)和与HES相关的YRPW基序(HEY)[12]等。

经典的Notch信号转导过程始于受体与邻近细胞表面以反式表达的膜结合配体结合，配体被泛素化，通过类似胞吞、机械拉伸的作用促进配受体结合，受体在整合素金属蛋白酶10(ADAM10)和γ-分泌酶的作用下发生蛋白水解[13]，使其胞内结构域被释放到胞质溶胶中，进入细胞核与核转录抑制子(recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region，RBPJ)和Mastermind-like的辅助激活剂(mastermind like transcriptional coactivator，MAML)蛋白家族相互作用形成Notch辅激活子复合物[14]。

非经典的Notch信号中，受体也可以被非经典的配体或在没有配体的情况下激发，Notch受体无需切割产生胞内结构域，甚至有些非经典途径无需RBPJ的参与，可以与其他胞核、胞质的效应物相互作用[11]。目前非经典的Notch信号通路在肿瘤学中的研究有较新进展，不过在病理性妊娠或妊娠并发症的相关机制研究中几乎没有涉及。

2 滋养层侵袭

2.1 胚胎植入与滋养层侵袭

胚泡的种植包括定位、黏附、穿透三个过程；人类胚胎的极端滋养层与子宫内膜的黏附需要表达于胚泡或子宫内膜表面相关细胞因子及黏附分子配受体的结合，促进胚泡与子宫内膜接触，滋养层细胞穿透内膜上皮，侵入子宫内膜间质，达到母体血管[15]，参与母体螺旋动脉重塑，属于胎盘形成的一部分，促进胎盘形成前母胎物质交换。滋养层逐渐分化为细胞滋养层(cytotrophoblasts，CTB)和合体滋养层(syncytiotrophoblasts，STB)，与胚外中胚层共同构成胚胎的绒毛膜结构[16]。

2.2 Notch信号通路与滋养层侵袭

Notch信号通路在滋养层的作用既表现为促进CTB不断向绒毛外滋养层(extravillous trophoblasts,EVTs)分化，并影响小鼠胚胎滋养层干细胞样祖细胞(trophoblast stem cell-like progenitor cells，TSPCs)自我更新的过程，促进滋养层向子宫内膜侵袭。目前的研究涉及Notch配受体及靶基因分子在胚胎组织的定位、与细胞因子的调控、互作以及具体通路机制。

Notch信号通路的相关配受体在人类胚泡的内细胞团和滋养层细胞中广泛表达，与细胞滋养层向EVTs的分化相关：Notch1、3和DLL1在CTB和STB中都有表达，Notch2、4和Jagged1、2仅定位于STB中[17]；体外培养发现未分化的小鼠滋养层干细胞表达Notch家族的所有成员，免疫荧光标记母胎界面的Notch配受体，发现人类胚胎CTB不表达Notch1，且随着滋养层侵袭Notch2表达上调、Notch4表达下调；DLL1在邻近滋养层的间质和血管腔室中表达，DLL4在CTB侵袭延伸的细胞柱中逐渐增加，却在其侵入子宫壁后迅速下调，Jagged1在滋养层分化侵袭的早期阶段是缺失的，却在母体螺旋动脉相关的CTB中显著上调[7]。以上研究中，Notch配受体在不同组织中的表达差异，可能反应了其功能差异，例如Notch2、4和DLL4的动态变化说明Notch2、4调节滋养层侵袭的先后顺序，DLL4可能与细胞滋养层向合体滋养层的分化迁移有关。

早期妊娠的建立涉及母胎界面广泛的血管重构、滋养层侵袭、及聚集于螺旋动脉周围的蜕膜NK细胞间的相互作用，Notch信号通路在其中都有参与，如动脉血的高氧状态与蜕膜NK细胞促进滋养层侵袭血管[18]。EphrinB2是血管内皮细胞的标记物之一，研究发现DLL4-Notch信号可以弥补EphrinB2表达缺失的HTR-8/SVneo细胞株的迁移和侵袭[19]。γ-分泌酶抑制剂阻断Notch受体胞内结构域切割和释放，抑制其活性[20]，研究发现滋养层细胞的侵袭受表皮生长因子样结构域7(EGFL7)的调节，EGFL7与Notch1在JEG3细胞(人绒毛膜癌细胞)中表达促进细胞迁移；γ-分泌酶抑制剂的存在下，过度表达EGFL7的滋养层细胞对基底胶的侵袭减弱[21]。小鼠胎盘滋养层侵袭过程中Notch2受体的条件性缺失损害了动脉侵袭，使母体血流量减少了30%～40%，胎盘灌注减少了23%[7]。

已经有研究表明Notch1是促进人胎盘绒毛外滋养层祖细胞增殖和存活的关键因素；另一方面，它又抑制TEAD4(TEA Domain Transcription Factor4)和p63基因表达对合体滋养层化的作用，这两种调节作用控制CTB自我更新[22]。转录因子TEAD4选择性在胚胎植入早期的小鼠胚胎TSPCs中表达，缺失的小鼠在妊娠9 d之前发生胚胎死亡。此外，通过收集URSA患者的胎盘，发现其绒毛形成的缺陷——仅存单一的滋养层斑块或缺乏滋养层细胞，滋养层柱受损。所以推测与胎盘绒毛形成缺陷相关的URSA与TSPCs中转录因子TEAD4的表达缺失相关[23]。

3 蜕膜化及母胎界面血管重建

狭义的蜕膜化是指子宫内膜基质细胞增殖分化为蜕膜基质细胞，糖原、脂滴和分泌颗粒在胞质中积累，粗面内质网、高尔基体扩张[15-16]，形成分泌型子宫内膜。广义的蜕膜化还包括血管重塑、子宫腺上皮细胞分泌增多、免疫细胞募集和分化[24]，其中，母胎界面的血管重建主要包括子宫螺旋动脉重塑和蜕膜毛细血管形成，Notch信号通路在其中发挥重要作用。

内皮细胞和周细胞不仅构成血管，也体现血管功能。VEGF、Notch信号通路共同协调血管内皮细胞形成“芽”“茎”的功能；周细胞又称为Rouget细胞(该细胞由Charles Rouget发现并命名)、壁细胞，位于血管基底膜内，胞核突出，胞质细长突起，沿血管走向包围其表面并延伸至邻近血管，维持微血管内稳态、促进血管发育和成熟[25]。Notch信号通路通过周细胞募集和分化调节血管功能[26]；周细胞中Notch信号的丢失降低了血小板衍生生长因子受体的水平，增加了周细胞凋亡[27]，并且，周细胞被认为是血管平滑肌细胞的前体[26]。目前的研究已明确Notch信号通路调控血管内皮细胞和平滑肌细胞的命运：新的血管形成时，尖端表型内皮细胞形成新的血管分支，而拖尾的茎细胞分化增殖形成管状结构，是因为Notch受体与不同的配体结合后产生不同的效应——高表达DLL膜蛋白的内皮细胞形成血管芽，高表达Jagged膜蛋白的内皮细胞形成血管茎[28]，其中，DLL4在调控与妊娠相关的蜕膜血管生成中发挥关键作用[29]。新的研究发现，Notch受体表达水平的高低可能更具意义，且与内皮细胞表达的血管内皮生长因子A(VEGFA)和趋化因子受体4(CXCR4)相关，而DLL4缺失的内皮顶端细胞的功能并不受影响[30]。此外，血管平滑肌细胞表达的Notch受体与配体Jagged1结合，促进了其本身的进一步增殖和分化[31-32]。

3.1 Notch信号通路与子宫螺旋动脉重塑

螺旋动脉重塑是EVTs与子宫螺旋动脉相互作用的结果。绒毛结构是母胎血管系统的一部分，也是胎盘形成过程中的一部分。EVTs侵入母体蜕膜，破坏了子宫螺旋动脉的收缩性，表现为动脉壁内血管平滑肌细胞逐渐被纤维组织和EVTs取代[15]，研究表明其与蜕膜NK细胞和EVTs分泌的血管生成素1、2(Angiopoietin,Ang)直接作用于血管平滑肌细胞有关[33]。

滋养细胞直接调控血管平滑肌细胞表型转换，其衍生的血小板衍生因子BB(PDGF-BB)是调节因子之一，大鼠子宫腺α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达量可以反映平滑肌细胞被破坏的程度[34]。孕酮和绒毛膜促性腺激素激活Notch1通路，Notch1通过启动基质细胞向蜕膜细胞的分化来促进α-SMA的表达并抑制基质细胞的凋亡——通过向卵母细胞供体子宫内输注人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)，使腺体和蜕膜基质Notch1蛋白表达水平显著增加，编码α-SMA的ACTA2基因对宫内hCG的反应显著增加，而ACTA2是Notch4的靶基因之一，体现了Notch信号通路在其中的作用网络[35]。

母胎界面的白细胞也参与子宫内膜蜕膜化中的螺旋动脉重塑：在妊娠期间，子宫自然杀伤细胞在蜕膜积累，又称为蜕膜自然杀伤细胞，在滋养细胞侵袭和子宫螺旋动脉重塑期间大量聚集[36]。蜕膜NK细胞与Notch信号通路虽然分别属于细胞水平和分子水平，但其作用在血管重塑方面有所交叉，而二者之间的关系尚未明确。目前有研究发现双花扁豆凝集素(DBA)染色阳性的蜕膜NK细胞表达DLL1，蜕膜NK细胞促进蜕膜非平面血管的生成[37]；DLL1和DLL4与人类蜕膜NK细胞的相应受体结合后，Notch信号通路被激活，促进蜕膜NK细胞产生IFNγ和血管生成因子，与母胎界面的血管修饰相关[38]。此外，Notch与VEGF信号通路在血管生成中的相互作用被广泛研究[39-40]，Notch信号通路与血管内皮生长因子及其受体和血管生成素在母胎界面相互作用，促进蜕膜血管系统发育。多氯联苯混合物Aroclor 1254(A-1254)是一种有毒物质，可以通过Notch4/DLL4/HEY2通路，诱导人脐静脉内皮细胞三维管形成的破坏，使小鼠胎盘和人滋养层或内皮细胞中血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)表达被抑制[41]。此外，Notch信号通路在3种人原代内皮细胞系(人脐静脉内皮细胞、人动脉内皮细胞和人微血管内皮细胞)中皆诱导血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)转录物和蛋白质表达，内皮细胞中VEGFR3的反式激活需要Notch/RBPJ结合位点[42]。

3.2 Notch信号通路与蜕膜毛细血管新生

除了子宫螺旋动脉的重塑，蜕膜新生毛细血管网也对胚胎植入后的生长发育至关重要，Notch信号通路中关键分子、蛋白或酶的缺失引起植入部位的毛细血管系统发育紊乱。ADAM10是一种Notch通路的调节因子，内皮细胞定向缺乏ADAM10的雌性A10 δ EC小鼠，具有高度特化的血管结构缺陷，生育能力严重低下，蜕膜化过程中血管扩张和重塑受损，妊娠4.5 d的A10 δ EC小鼠子宫内膜内皮细胞的核糖核酸测序显示Notch靶基因(HEY1，HES1)的下调[43]。运用植入后、胎盘形成前母体内皮细胞缺失Jagged1的小鼠，探讨母体螺旋动脉和蜕膜毛细血管在胎盘形成前如何支持胚胎发育，发现Notch信号通路的效应物HEY2和锚蛋白重复蛋白(NRARP)的表达增加，从而增加了蜕膜重塑血管生成区域的内皮细胞中Notch信号活性，VEGFR2表达减少，该病理变化仅限于植入部位的毛细血管内皮细胞[44]。

4 结语与展望

Notch信号通路参与胚胎种植与蜕膜化机制，其相关配受体、转录因子、靶基因在母胎界面广泛表达和分布，并受雌孕激素及绒毛膜促性腺激素的调节和互作，其通路相关蛋白和负调节因子的研究为Notch信号通路在胚胎种植和蜕膜化的作用提供了间接证明。URSA是排除染色体异常、内分泌失调、解剖结构异常及抗磷脂抗体综合征等原因后的复发性流产，母胎界面Notch信号通路转导失常导致滋养层侵袭或血管重塑异常均不利于胚胎的顺利植入和发育，是URSA发病机制的可能性之一。URSA患者妊娠期间螺旋动脉的重塑程度与对照组相比明显减轻，且与蜕膜NK细胞数量增加呈大致的同步变化[45]，螺旋动脉壁厚度也明显增高，与蜕膜NK细胞的密度有关[46]，说明聚集在蜕膜组织螺旋动脉周围的NK细胞对螺旋动脉重塑有着关键的作用——Notch信号通路不但参与到滋养层侵袭和螺旋动脉的过程中，甚至有可能通过调节NK细胞的功能而发挥作用，有望据此进一步展开研究。