血浆Netrin-1、VEGF 水平与严重冠脉狭窄患者冠脉侧支循环形成的关系

张志杰，王健，颜培冉，王世勋

1 潍坊医学院临床医疗系，山东潍坊 261000；2 潍坊市人民医院心内二科

冠状动脉（冠脉）侧支循环（CCC）作为连接严重冠脉狭窄病变之间的通道，在为心肌缺血区提供血流的同时，可以减轻左室舒张功能障碍，缩小心肌梗死面积，降低心肌梗死病死率［1-2］。研究发现，CCC形成是在缺氧诱导下，基因表达所介导的流体剪切应力、炎症反应等因素相互作用的结果［3］。血管内皮生长因子（VEGF）作为最具代表性的血管生成因子，在诱导血管平滑肌细胞迁移方面发挥重要作用［4］。随着冠脉狭窄程度的加重，存在CCC者VEGF水平高于无CCC 者［5］。动物研究显示，缺血时间延长会诱导VEGF 高表达，尤以缺血区丰富［6］。神经和血管的生成复杂且相似，二者在生长发育过程中可以利用相同的信号及传导通路［7］。神经轴突诱导因子-1（Netrin-1）在结构上与内皮有丝分裂原同源，它可以调节内皮细胞生长增殖［8-9］。结直肠癌缺失基因（DCC）、不协调同源基因-5B（UNC-5B）是Netrin-1 的主要受体，Netrin-1 与DCC 结合会刺激血管生成，与UNC-5B 结合则相反［7］。Netrin-1 刺激体内血管生成的同时，还可以增强VEGF 促血管生成活性［10］。目前关于Netrin-1 是否参与CCC 形成，尚未见相关报道。本研究旨在探讨血浆Netrin-1、VEGF水平与严重冠脉狭窄患者CCC形成的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2021 年6 月—2022 年4 月因不稳定性心绞痛于潍坊市人民医院心内二科住院的154 例患者，冠脉造影检查均显示严重冠脉狭窄（左前降支、左回旋支或右冠状动脉中至少有1 支血管狭窄程度≥95%）。排除标准：曾行冠脉旁路移植术（CABG）、严重心脏瓣膜病及瓣膜置换术史；恶性肿瘤；慢性肾功能不全；严重肝功能不全；血液系统疾病；慢性阻塞性肺疾病；外周血管病；炎症及自身免疫性疾病。本研究通过潍坊市人民医院伦理委员会批准，患者签订知情同意书。

1.2 资料收集 收集患者入院后的基本资料，包括性别、年龄、BMI、吸烟史、糖尿病史、高血压史、高脂血症史、经皮冠状动脉介入治疗（PCI）史、白细胞（WBC）、中性粒细胞百分比（GRAN）、B 型钠尿肽（BNP）、尿酸（UA）、高敏肌钙蛋白（hs-cTnI）、TC、LDL-C、HDL-C、ALT、血肌酐（CREA）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、促甲状腺激素（TSH）、射血分数（EF）及抗血小板药物、他汀类药物、血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ACEI/ARB）、β-受体阻滞剂使用情况。糖尿病诊断标准：空腹血糖＞7.0 mmol/L、随机血糖＞11.1 mmol/L 或目前正在口服降糖药物［11］。高血压诊断标准：收缩压（SBP）≥140 mmHg 和（或）舒张压（DBP）≥90 mmHg，对于目前正在口服降压药物的患者，即使血压＜140/90 mmHg，也定义为高血压［12］。高脂血症诊断标准：TC≥5.18 mmol/L、LDL-C≥3.73 mmol/L、TG≥1.70 mmol/L，符合其中之一可以诊断［13］。

1.3 冠脉造影检查及CCC 分组 采用Junkins技术进行多体位冠脉造影，至少观察6～8 个心动周期。分别由2 名冠脉介入专家采用盲法对冠脉造影图像进行评估，若判读结果不一致，则由第3名专家进行评估，最终统一结论。Cohen-Rentrop分级评价CCC，0级：未发现侧支血管；1级：存在侧支血管，但心外膜段未见充盈；2级：侧支血管部分充盈心外膜段；3级：侧支血管完全充盈心外膜段；合并多支病变的患者，以Rentrop 分级最高级来表示。根据Cohen-Rentrop分级将患者分为CCC 不良（0、1 级）组37 例、CCC 良好（2、3级）组117例。

1.4 冠脉病变评价 采用Gensini评分根据狭窄程度和部位对冠脉病变进行评价［14］，冠脉狭窄程度评分：狭窄≤25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%～75%为4 分，＞75%～90%为8 分，＞90%～＜100%为16分，100%为32 分；冠脉狭窄部位评分系数：左主干为5.0，左前降支近段和左回旋支近段为2.5，左前降支中段为1.5，左前降支远段、第一对角支、左回旋支远段、钝缘支、右冠状动脉及后降支为1.0，第二对角支及后侧支为0.5。Gensini 评分=冠脉狭窄程度评分×冠脉狭窄部位评分系数，最终评分结果为各支冠脉评分之和。慢性完全闭塞（CTO）［15］标准：在动脉粥样硬化不断进展的基础上血栓形成与血栓机化所导致的冠脉管腔完全闭塞，心肌梗死溶栓试验（TIMI）分级为0级，且闭塞病程超过3个月。

1.5 血浆VEGF、Netrin-1 检测 完成冠脉造影检查后，均经桡动脉鞘留取血标本，在30 min内送入本院中心实验室以2 000 r/min 离心10 min，离心半径10 cm，吸取上层血浆，保存于-80 ℃冰箱待测。采用酶联免疫吸附法（试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司）检测血浆VEGF、Netrin-1。

1.6 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，比较采用非参数秩和检验；计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用χ²检验；采用Pearson 相关法分析VEGF 与Netrin-1 的相关性；应用二元Logistic 回归分析CCC 形成良好的独立影响因素；绘制受试者工作特征（ROC）曲线评估VEGF、Netrin-1 及VEGF联合Netrin-1对CCC 形成良好的预测价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料及冠脉造影结果比较 与CCC不良组比较，CCC 良好组年龄小（P＜0.05），Gensini评分、CTO 发生率高（P均＜0.05）；两组其他临床资料比较，P均＞0.05。见表1。

表1 两组临床资料及冠脉造影结果比较

2.2 两组血浆VEGF、Netrin-1 水平比较 与CCC不良组比较，CCC 良好组血浆VEGF、Netrin-1 水平高（P均＜0.05），见表2。Pearson 相关分析显示，血浆VEGF 与Netrin-1 水 平呈正相关（r=0.408，P＜0.05）。

表2 两组血浆VEGF、Netrin-1水平比较（pg/mL，）

表2 两组血浆VEGF、Netrin-1水平比较（pg/mL，）

2.3 CCC 形成良好的影响因素 将年龄、VEGF、Netrin-1、Gensini评分纳入多因素分析。CTO发生率与Gensini评分在冠脉病变程度方面具有共线性，综合考虑后只将Gensini 评分纳入多因素Logistic 回归分析。多因素回归分析结果显示VEGF（OR=1.012，95%CI：1.007～1.018，P＜0.05）、Netrin-1（OR=1.006，95%CI：1.001～1.010，P＜0.05）、Gensini评分（OR=1.042，95%CI：1.010～1.075，P＜0.05）为CCC形成良好的独立影响因素。

2.4 血浆VEGF、Netrin-1 水平对CCC 形成良好的预测价值 ROC 曲线显示，血浆VEGF 水平预测CCC 形成良好的最佳截断值为384.88 pg/mL，灵敏度为80.34%，特异度为89.19%，曲线下面积为0.906；血浆Netrin-1 水平预测CCC 形成良好的最佳截断值为950.03 pg/mL，灵敏度为66.67%，特异度为94.59%，曲线下面积为0.884；两者联合预测CCC 形成良好的灵敏度为86.32%，特异度为91.89%，曲线下面积为0.951。

3 讨论

目前冠心病依然是全世界范围内死亡的主要原因［16］，PCI和CABG为存在严重冠脉狭窄的患者提供了治疗策略，然而并不是所有的患者适合冠脉血运重建。尽管目前PCI 水平不断提高，医疗器械不断改进，其中包括主动脉内球囊反搏（IABP）、体外膜肺氧合等生命支持装置，在很大程度上提高了PCI的成功率。但支架内血栓形成、支架内再狭窄、冠脉穿孔、缺血再灌注损伤等手术并发症也随之而来。CCC的形成对于心肌缺血而言是一种重要的代偿机制，冠脉闭塞发生后，它可以为闭塞节段远端的心肌提供血液供应［17］。良好冠脉侧支的存在对左心室功能的维持起重要作用，甚至有一些案例表明左主干或三支血管闭塞的患者仅存在轻微症状。发育良好的CCC 可以将患者病死率降低约35%［2］。不同患者CCC 的发展具有很大异质性，即使在冠脉狭窄程度相似的患者中也是如此。CCC 形成的机制仍未阐明，其形成受许多因素影响。研究指出，CCC是预先存在的微小侧支血管重塑的结果，冠脉狭窄之间压力梯度所导致的流体剪切应力会刺激内皮细胞产生一氧化氮（NO）和单核细胞趋化蛋白-1，进而诱导包括内皮祖细胞在内的单核细胞，介导血管重塑［18］。老年、女性、冠心病危险因素和肾功能不全与CCC不良相关；而高血压，特别是舒张压升高与CCC 形成良好有关［19］。这一过程也受到促血管生成因子［17，20］以及脂肪因子（波形蛋白-1、脂肪连接蛋白）等［21-22］的调节。

Netrin-1 是层粘连蛋白家族中的一种分泌型蛋白质，最初以其轴突引导和细胞迁移功能被发现［23］。越来越多的证据表明，Netrin-1为血管生成的关键调节因子。在体内和体外实验中，它可以特异性刺激血管内皮细胞的增殖、迁移和黏附，其效果与VEGF、血小板衍生生长因子及纤维连接蛋白相似。Netrin-1 在与VEGF 协同作用时可以增强血管生成活性［10］。本研究结果显示，CCC 良好组Netrin-1、VEGF 水平升高，而且二者呈正相关。在成熟主动脉内皮细胞中，Netrin-1可以促进血管生成。主动脉内皮细胞较脐静脉内皮细胞而言，与冠脉的生理学更加相似，这为研究Netrin-1 在促进CCC 形成方面的作用提供更强有力的证据；并且Netrin-1 通过DCC 受体依赖的ERK1/2-eNOS 前馈机制来调节血管生成，在该信号传导机制中NO 起到了关键作用［9］。研究显示，VEGF 与Netrin-1 具有相同的下游信号通路，VEGF 通过增加内皮型一氧化氮合酶的表达来促进NO 的释放，进而介导血管生成［24］。尽管目前尚无明确证据表明Netrin-1、VEGF 之间的因果关系，但基于上述研究可以推测，Netrin-1 可能通过促进NO 的产生来增强VEGF 的促血管生成活性。在心肌缺血条件下，NO可以通过多种机制发挥心脏保护作用。如前所述，Netrin-1 与DCC 受体结合后会诱导NO 的产生。显然，NO 在Netrin-1 减轻心肌缺血损伤方面起着不可替代的作用。研究发现，DCC 受体在小鼠心脏中大量表达，通过离体心脏灌流系统用Netrin-1 灌注心脏会显著增加NO 的产生。在缺血再灌注情况下，Netrin-1预灌注会使心肌梗死面积显著减小，它的这一作用可以被NO 清除剂和DCC受体拮抗剂所逆转［25］。

鉴于Netrin-1 在心血管系统中的保护作用，本研究检测了CCC 良好和CCC 不良患者血浆Netrin-1水平。本研究首次证实，CCC良好患者血浆Netrin-1水平高于CCC 不良患者。多因素Logistic 回归分析表明血浆Netrin-1、VEGF 水平依然为CCC 形成良好的独立影响因素，ROC 曲线进一步确定了它的预测价值。尽管CCC 良好者血浆Netrin-1 水平较高的潜在机制尚未完全阐明，但是Netrin-1 的促血管生成机制或许能提供一定的参考价值。除此之外，本研究发现Gensini 评分为CCC 形成良好的独立影响因素，这与既往的研究结果一致［21］。

总之，血浆Netrin-1、VEGF 水平与CCC 形成良好密切相关。血浆Netrin-1 及VEGF 是严重冠脉狭窄患者CCC形成的独立影响因素，并且可能是CCC形成良好与否的生物标志物。本研究存在以下局限性，首先样本量较少；其次，本研究只评估了Netrin-1、VEGF 与CCC 的相关性，未同时纳入其他促血管生成因子；第三，尽管本研究证实Netrin-1、VEGF 为CCC形成良好的独立预测因子，但并未证明Netrin-1、VEGF 能否成为潜在治疗靶点；最后，利用Rentrop评分进行CCC 分级，较侧支血流指数（CFI）准确性差，但CFI为侵入性定量评估方法，无法确定评估过程中患者的生命安全。