微量元素Fe、Co、Ni对养殖粪污厌氧发酵产气性能及微生物群落结构影响

＊韦采妮 赵晨菊 黄河笑 李显芳 万巧玲 余薇薇*

（1.重庆交通大学河海学院水利水运工程教育部重点实验室 重庆 400074 2.国家城市供水水质监测网重庆监测站 重庆 400060 3.重庆市渝东水务有限公司 重庆 404000）

我国畜禽养殖业发展迅速，2013年重庆市养猪当量411.81万头，粪便产量达226.93万吨[1]。大量畜禽粪便带来了较严重的农业面源污染问题，厌氧发酵工艺具有良好的生物降解性能，作为农村消纳畜禽粪便，实现畜禽粪污无害化、资源化处理的有效途径，可将各种有机物转化为CH4和CO2，获得可再生生物燃料。富含营养物质的消化沼液可作为肥料施用，改良农田和土壤。猪粪中有机质含量、TN、TP等达24.16%、2.65%、0.68%，具有较高的沼气生产潜力[2]。但厌氧发酵工艺存在原料利用率低、易出现酸化和氨氮抑制等问题。通过添加Fe、Co、Ni、Mo元素，改善了食物废弃物厌氧发酵系统的稳定性和提高发酵性能[3]，微量元素缺乏是造成厌氧发酵性能差的首要原因。

微量元素是微生物生长不可缺少的营养物质，产甲烷菌生长到1.32g/L左右时会缺Fe，而产甲烷菌生长到4.830g/L和30g/L时则会相应缺乏Ni和Co等元素[4]。此前的研究厌氧发酵工艺性能优化主要集中于对有机污染物的去除效率，且多为单一元素投加作用。因此，本次研究比较一定浓度的单一和混合元素对猪粪厌氧发酵系统中产气性能微生物群落的影响。研究结果可为提高猪粪厌氧发酵性能提供理论借鉴。

1.材料与方法

(1)样品采集与接种

猪粪取自重庆市农户和养猪场，接种污泥取自污水处理厂厌氧池，接种前将驯化好的接种污泥在70～90℃条件下经2h热处理，降低产甲烷菌的活性。称取一定量粪污、接种污泥与蒸馏水搅拌均匀，使发酵浓度调整为6.0% VS，初始pH调至中性，将配制发酵底物加入厌氧发酵罐中，温度设定为37.0±0.5℃，搅拌速率设置为120r/min。

(2)实验设计

①微量元素对厌氧发酵产气影响

根据前实验确定厌氧发酵系统促进COD降解最佳微量元素投加量，微量元素以水溶液形式加入，实验设置五组：实验Ⅰ为空白组；实验Ⅱ单一Fe（FeCl2·4H2O）元素10mg/L；实验Ⅲ单一Co（CoCl2·6H2O）元素1.5mg/L；实验Ⅳ单一Ni（NiCl2·6H2O）元素0.8mg/L；实验Ⅴ混合Fe、Co、Ni，投加量分别为9mg/L、1mg/L和0.7mg/L。

②微量元素对厌氧发酵微生物群落影响

采集产气高峰期添加不同微量元素的厌氧发酵罐中污泥，采集的样品经10000rpm离心10min，去除上清液，-80℃液氮保存送至上海美吉生物技术有限公司。

(3)分析方法

产气量采用排饱和食盐水法测定；样品DNA使用Fast DNA®SPIN Kit for Soil试剂盒提取；使用细菌和古菌的通用引物515FmodF（GTGYCAGCMGCCGCGGTAA）和806RmodR（GGACTACNVGGGTWTCTAAT），针对16SrRNA基因的V4区进行PCR扩增。扩增条件为：95℃下初期变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃下延伸45s，循环26次；72℃下延伸10min。纯化产物进行MiSeq高通量测序，使用QIME1.9进行数据分析。

2.结果与分析

(1)产气特性

添加单一Co、Ni和混合Fe、Co、Ni厌氧发酵沼气日产量和累积产量均高于对照组，发酵第30天结束时，累积产气量与对照组相比分别提高了1.18倍、1.69倍和1.85倍。添加单一10mg/L Fe略低于对照组，但累积产气曲线还呈上升趋势，推测添加单一Fe元素组还未发酵完全。有报道指出50～4000mg/L浓度的Fe2+有利于沼气的产生[5]，说明促进COD降解与促进厌氧发酵产气的微量元素有效添加量有一定差异。Zhang等[6]研究发现在厌氧发酵后期Fe2+的添加会抑制纤维素酶的活性，产气量低于未添加Fe2+组。微量元素的补充量与发酵基质、接种物以及装置的运行方式有关，发酵装置和发酵物不同参与各阶段产气途径所需辅酶的比列会发生变化。单一微量元素中，Ni元素对产沼气的促进作用优于Fe元素和Co元素，这可能对Ni元素在甲烷过程中参与CO脱氢酶、辅酶F430和甲基-辅酶M还原酶等的合成与催化起着关键作用[7]。单一微量元素对产气量的促进效果低于混合微量元素，这可能是因为混合元素之间产生协同作用。

(2)微生物群落多样性与结构特性

①微生物多样性

经高通量测序，在OTUs为97%序列相似性水平下采用丰富度指数（Ace、Chao1）、多样性指数（Shannon、Simpson）和深度指数（Coverage）对样品中微生物群落进行分析，分析结果如表1。发酵产气高峰期时的5个样品的测序Coverage指数值均达99%，可全面有效解析发酵体系中微生物群落变化情况。Ace和Chao1指数可以反映微生物群落丰富度，同时Shannon指数越大和Simpson指数越小表示微生物群落的多样性越高。随着Fe、Co、Ni元素的投加，Ace、Chao1和Shannon指数均大于空白组，且Simpson指数均小于空白组，说明添加Fe、Co、Ni元素增加了厌氧发酵系统中微生物丰富度和多样性。

表1 Illumina测序数据统计分析

(3)微生物群落结构

厌氧发酵过程通过多种微生物协调配合作用，经过水解、产氢产酸和产甲烷阶段，最终产生沼气，厌氧发酵系统的产气性能与微生物群落结构密切相关。在门类水平上，主要优势菌种为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、广古菌门。微生物发酵产沼气主要为产氢产酸和产甲烷阶段。变形菌门主要用于降解粗蛋白质为小分子物质，以供产酸和产甲烷阶段微生物分解转化，同时能够促进粪便中碳氮的转化[8]，添加单一Fe元素组的变形菌门占14.09%，相比空白组提高了7.59%，Fe元素的投加有助于变形菌门的生长。有研究指出厚壁菌门在富含纤维素底物中较为丰富，将木质纤维素降解为有机酸，是水解酸化阶段主要细菌群[9]，添加单一Fe元素、Co元素、Ni元素和混合Fe、Co、Ni元素的厚壁菌门丰度分别比空白实验组提高了6.41%、10.46%、11.23%和7.55%，微量元素的投加促进发酵系统中的厚壁菌门丰度增大。而拟杆菌门参与木质纤维素和多糖的利用，可在厌氧发酵过程中将有机物转化为乙酸[10]，微量元素投加组拟杆菌门丰度明显降低，表明微量元素对拟杆菌门具有抑制作用。

在属水平上，主要以梭菌属、土耳其螺属、产芽胞厌氧菌和固氮菌为主，优势菌属相对丰度在各实验组中差别不大，不同微量元素对产甲烷菌的影响较大，产甲烷菌与甲烷产量存在密切关系，各实验组的古菌主要为甲烷短杆菌和甲烷八叠球菌。甲烷短杆菌和甲烷八叠球菌分别属于氢营养型产甲烷菌、乙酸营养学产甲烷菌，可促进氢营养化和乙酸分解产甲烷作用。添加Fe、Co、Ni和混合Fe、Co、Ni元素甲烷短杆菌比例分别提高了1.14%、0.59%、1.23%、3.76%。各实验组甲烷八叠球菌比例分别为0.49%、0.28%、0.44%、0.35%和1.46%，投加混合元素协同作用可促进甲烷八叠球菌的生长，而微量的Fe、Ni元素对甲烷八叠球菌的增长表现出轻微的抑制，投加微量元素使产甲烷菌群落呈产乙酸营养型富集。因此投加Fe、Co、Ni元素对主要优势菌群种类没有影响，但优势菌群的总占比有明显提高，有利于水解产酸菌群和产甲烷菌群的繁殖和群落结构的稳定，提高了发酵系统的稳定性和产气性能。

3.结论

（1）添加一定浓度微量元素可以提高养猪粪污厌氧发酵中沼气的产量，混合Fe、Co、Ni元素的协同作用，对于促进厌氧发酵产气效果最优，有效促进了厌氧发酵的启动和产气高峰提前出现，加速厌氧发酵的进程。

（2）微量Fe、Co、Ni元素的添加增加了微生物群的丰度和多样性，刺激优势菌群的生长和繁殖，从而提高厌氧发酵沼气产速率与产气量。