骨骼肌特异性Chrono 过表达对小鼠运动能力和糖耐量的影响

严露,张缨

(1.北京体育大学运动与体质健康教育部重点实验室,北京 100084;2.北京体育大学运动人体科学学院,北京 100084)

骨骼肌占人体体重约40%[1],是重要的代谢调节组织,可将大部分餐后血糖吸收摄取并储存,对于维持血糖水平的稳定至关重要[2-4]。 骨骼肌糖代谢水平则是影响有氧运动能力的重要因素[5],而骨骼肌糖代谢水平会受到生物钟的调控[6]。 BMAL1(brain and muscle ARNT-like protein 1)是核心生物钟分子,可与CLOCK (circadian locomotor output cycles kaput)形成BMAL1-CLOCK 异二聚体,它们作为转录因子可调控生物钟靶基因的转录[7-8]。Chrono( computationally highlighted repressor of network oscillator,也称Gm129、Ciart、C1orf51 等)是近年新发现的生物钟基因[9],其编码的CHRONO 蛋白可直接与转录因子BMAL1 相结合,并反馈性抑制BMAL1-CLOCK 的转录活性[10-11], CHRONOBMAL1 被认为是调控生物节律的重要通路。 另外,研究发现,骨骼肌生物钟核心分子BMAL1 参与调节骨骼肌胰岛素敏感性[12],调控骨骼肌中糖代谢相关基因表达的节律性变化,以维持血糖水平稳定[13],骨骼肌BMAL1 缺失则会显著降低骨骼肌葡萄糖摄取[6,l4-15]和糖耐量水平[16]。 因此,BMAL1 不仅参与骨骼肌生物钟调节,可能也是调节骨骼肌糖代谢的重要分子。 然而,CHRONO 作为BMAL1 的转录抑制因子,CHRONO-BMAL1 通路是否会对糖耐量产生影响? 进而影响运动能力呢? 这些问题目前未见相关文献报道。

因此,本研究拟通过骨骼肌特异性Chrono过表达和野生型小鼠,探讨CHRONO-BMAL1 通路对糖耐量和运动能力的影响,为阐明调节糖耐量与影响骨骼肌健康的新机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

20 只8 周龄SPF 级C57BL/6N 野生鼠(Wild Type,WT),其中雄性10 只,体重(22.65 ± 0.21)g,雌性10 只,体重(18.41 ± 0.13)g。 20 只8 周龄SPF 级骨骼肌特异性Chrono过表达鼠(Chrono-TG),其中雄性10 只,体重(23.16 ± 0.37)g,雌性10 只,体重(18.69 ± 0.29)g。 WT 鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供【SCXK(京)2016-0006】,Chrono-TG 鼠其背景为C57BL/6N 鼠,由赛业生物科技有限公司制作,中国医学科学院医学实验动物研究所负责繁育【SCXK(京)2019-0011】。

所有小鼠饲养及测试工作均在北京体育大学动物房【SYXK(京)2021-0053】完成。 动物房室内温度维持在25℃左右,相对湿度60% ～ 70%,12 h光照～12 h 黑暗周期(7:00 开,19:00 关)。 饲养采用国家啮齿类动物标准饲料,整个饲养过程动物可以自由饮水、进食。 本研究经北京体育大学运动科学实验伦理委员会批准(批准号:2021042A)。

1.1.2 主要试剂与仪器

血浆胰岛素试剂盒(GEL2579-B,金恩来,中国北京),糖原含量检测试剂盒(BC0345,索莱宝,中国北京),RNAiso Plus(9109,TaKaRa,日本),逆转录试剂盒(FSQ101,Toyobo,日本),SYBR Green Realtime PCR Master Mix(QPK-201,Toyobo,日本),18S引物( QT02448075, QIAGEN, 德 国)、Chrono引 物(QT01533749,QIAGEN,德国)。

小动物体成分分析仪(Echo-MRI,美国),小鼠自主活动转轮笼系统(武汉一鸿科技,中国),动物跑台(Columbus Instruments,美国),小鼠抓力测试仪(北京众实迪创科技,中国),血糖仪及血糖试纸(三诺GA-6,中国),组织研磨仪(Next Advance,美国),低温离心机(Eppendorf,德国),微量分光光度计(NanoDrop 2000,Thermo Fisher Scientific,美国),PCR 扩增仪(A300,LongGene,中国杭州),荧光定量PCR 仪(ABI7500,美国)。

1.2 方法

1.2.1 体重、摄食量记录及体成分测试

定时记录各组小鼠每周体重及摄食量。 采用小动物体脂成分分析仪对各组小鼠的脂肪含量和瘦体重含量进行分析测定。

1.2.2 自主活动性测试采用小鼠自主活动转轮笼系统连续记录采集黑暗下72 h 小鼠自主活动情况。

1.2.3 递增负荷运动能力测试

递增负荷运动能力测试参照Burch 等[17]的研究并进行了改良。 具体如图1:跑台+5°坡度,以10 m/min 速度跑5 min,6 min 跑速增为13 m/min,之后每3 min 增加跑速3 m/min,让小鼠运动至力竭。力竭的判断标准是:小鼠不能维持现有跑速继续运动,机械刺激和电刺激小鼠10 s 以上仍不能继续运动即判断为力竭。

1.2.4 抓力测试

先进行3 d 的抓力测试适应,正式测试时让小鼠两只前爪握住抓力杆,测试者抓住小鼠尾巴让小鼠身体与抓力仪保持平行,并保证小鼠两前爪能持续稳定的发力,记录下持续发力阶段的握力最大值和平均值。

1.2.5 血糖及葡萄糖耐量测试

采集小鼠尾静脉血,测试小鼠在非禁食状态下的血糖值。

葡萄糖耐量试验(glucose tolerance test,GTT):小鼠禁食8 h 后,根据体重通过腹腔注射1 g/kg 体重的葡萄糖溶液(100 mg/mL)。 检测小鼠尾静脉末梢血糖水平,记录下注射前(0 min)及注射后15、30、45、60、90 和120 min 7 个时间点的血糖值。

计算血糖曲线下面积(area under the curve,AUC)=(0 min 血糖值+15 min 血糖值)×15/2+(15 min 血糖值+30 min 血糖值)×15/2+(30 min 血糖值+45 min 血糖值)×15/2+(45 min 血糖值+60 min 血糖值)×15/2+(60 min 血糖值+90 min 血糖值)×30/2+(90 min 血糖值+120 min 血糖值)×30/2。

1.2.6 动物取材及骨骼肌称重

收集小鼠眼眶后静脉血并制备血浆,随后脱颈处死,取心脏、肝和肾,并迅速分离腿部骨骼肌,对各块骨骼肌进行称重记录,随后用锡纸包好编号,投入液氮并转入-80℃保存。

1.2.7 血浆胰岛素测定

按照试剂盒说明书测定小鼠血浆中胰岛素含量。

1.2.8 骨骼肌糖原含量检测

取50 mg 腓肠肌,按照试剂盒说明书进行糖原提取与测定。

1.2.9 实时荧光定量PCR

提取腓肠肌总RNA,检测目的基因Chrono、肌球蛋白重链I 型(MyhcI)、肌球蛋白重链IIa 型(MyhcIIa)、肌球蛋白重链IIb 型(MyhcIIb)、肌球蛋白重链IIx 型(MyhcIIx)、丙酮酸脱氢酶E1α 亚单位(Pdha1)的相对表达。 除内参18S和Chrono外,其余引物序列由 Primerbank ( https:/ /pga. mgh.harvard.edu/primerbank/index.html)网站查询获得,见表1,由Thermo Fisher Scientific 合成。 取50 mg腓肠肌组织,加入800 μL 预冷的RNAiso Plus 进行组织研磨,4℃,11 304 r/min 离心10 min 后取上清,氯仿分相,取上层无色水相用异丙醇分离RNA,4℃,11 304 r/min 离心20 min 后用75%乙醇洗涤RNA,然后进行干燥,再悬浮,得到总RNA 提取液。测定所提RNA 浓度及纯度,之后进行逆转录,反应条件为65℃,5 min;37℃,15 min;98℃,5 min。 加入反应体系和相应的引物进行实时荧光定量PCR 检测。 通过仪器自带软件读取实时荧光量CT 值,用比较CT 法对目的基因的表达进行相对定量,公式如下:目的基因=2-ΔΔCT。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.3 统计学分析

用SPSS 软件进行数据的统计处理,结果用平均值 ± 标准误差(x-±sx-)表示。 采用独立样本t检验对数据进行分析,P＜ 0.05 和P＜ 0.01 分别代表具有显著性和非常显著性差异。

2 结果

2.1 各组小鼠不同组织Chrono mRNA 表达

在TG 鼠中,雌鼠骨骼肌ChronomRNA 表达显著高出雄鼠65.36%;与WT 鼠比,其雄、雌鼠的心脏和肾中ChronomRNA 的表达略高,Chrono-TG 雄鼠心脏和肾中ChronomRNA 表达分别为WT 雄鼠的2.6 倍和2.07 倍,TG 雌鼠肾中ChronomRNA 表达为WT 雌鼠的3.98 倍,而TG 鼠腓肠肌(gastrocnemius)的ChronomRNA 表达则非常显著地高于WT 鼠,雄鼠高49.88 倍,雌鼠高99.45 倍(图2)。

2.2 各组小鼠体重、摄食量及体成分变化

在Chrono-TG 鼠中, 雌鼠体重从(18.69 ±0.29)g 增长至(21.00 ± 0.35) g,雄鼠体重从(23.16 ± 0.37)g 增长至(25.46 ± 0.39)g,整个饲养周期中雌鼠体重始终显著低于雄鼠(P＜ 0.01),TG 雌鼠在第1、2 周摄食量明显低于雄鼠(P＜0.05),体脂百分比和瘦体重百分比则无明显变化;在WT 鼠中,雌鼠体重从(18.41 ± 0.13)g 增长至(21.49 ± 0.21)g,雄鼠则从(22.65 ± 0.21)g 增长至(26.62 ± 0.25)g,雌鼠体重始终显著低于雄鼠(P＜ 0.01),且雌鼠在第2、3、4、5 周的摄食量均显著低于雄鼠(P＜ 0.05 或P＜ 0.01)。Chrono-TG 雄鼠体重在第4、5 周分别为(25.09 ± 0.36)g 和(25.46 ±0.39)g,WT 雄鼠体重在第4、5 周则为(26.13 ±0.30)g 和(26.62 ± 0.25)g,在这两周TG 雄鼠体重明显低于WT 雄鼠(P＜ 0.05)(图3)。

2.3 各组小鼠自主活动变化

图4A 可以看出,TG 鼠中雄鼠自主转轮活动总量为(20 628.91 ± 2 108.31)m,雌鼠自主转轮活动总量为(25 323.53 ± 2 772.84)m,雌雄并无明显差异,WT 鼠中雄鼠自主转轮活动总量为(30017.26 ±1913.43)m,雌鼠为(35920.16 ± 1131.04)m,雌性活动总量显著高于雄性(P＜ 0.05);TG 鼠与WT 鼠相比,雌、雄鼠的自主转轮活动总量均显著降低(P＜ 0.01)。 图4B 显示,在TG 鼠中,其雄鼠和雌鼠在全天24 h 内的转轮活动量无显著变化,在WT 鼠中,雌鼠在夜晚(19:00 ～ 7:00)明显高于雄鼠(P＜0.05 或P＜ 0.01);TG 鼠与WT 鼠相比,雌、雄鼠在夜晚的转轮活动量均明显减少(P＜ 0.05 或P＜0.01)。

2.4 各组小鼠跑台运动能力变化

从图5 知,在TG 鼠中,雄鼠进行递增负荷至力竭的运动时间为(43.76 ± 1.57)min,运动距离为(1218.81 ± 77.53)m,雌鼠运动时间为(44.17 ±1.14)min,运动距离为(1233.35 ± 57.90)m,雌雄之间无明显变化;WT 雄鼠运动时间为(51.34 ±1.35)min,距离为(1608.34 ± 75.22)m,WT 雌鼠运动时间为(48.78 ± 1.81)min,距离为(1480.42 ±96.47)m,与WT 鼠比,TG 鼠其雌、雄鼠运动时间和距离均显著下降(P＜ 0.05 或P＜ 0.01)。

2.5 各组小鼠葡萄糖耐量、非禁食血糖和胰岛素浓度变化

如图6A 所示,在TG 鼠中,雌鼠在第30、45、60、90、120 min 的血糖值显著低于雄鼠(P＜ 0.01),WT鼠中,雌鼠在第0、30、45、60、90、120 min 的血糖值明显低于雄鼠(P＜ 0.05 或P＜ 0.01);TG 鼠与WT鼠相比,其雌、雄鼠在第15、30、45、60、90、120 min这6 个时间点的血糖值都显著升高(P＜ 0.05 或P＜ 0.01)。 图6B 显示,TG 雄鼠GTT 曲线下面积(AUC) 为(1161.82 ± 25.56),TG 雌 鼠AUC 为(1028.58 ± 18.30),WT 雄鼠AUC 为(1004.68 ±20.25),WT 雌鼠AUC 为(897.64 ± 22.34)。 在TG鼠和WT 鼠中,雌鼠AUC 均显著低于雄鼠(P＜0.01),TG 鼠与WT 鼠相比,其雌、雄鼠AUC 均显著升高(P＜ 0.01)。 图6C 和6D 可以看出,TG 鼠中雌鼠非禁食血糖为(6.58 ± 0.25)mmol/L,血浆胰岛素浓度为(9.79 ± 0.17)mIU/L,雄鼠非禁食血糖为(6.91 ± 0.12)mmol/L,胰岛素为(9.69 ± 0.18)mIU/L,雌雄之间无明显差异,WT 鼠中雌鼠非禁食血糖为(6.22 ± 0.13)mmol/L,显著低于雄鼠的(6.93 ± 0.24)mmol/L(P＜ 0.05)。

2.6 各组小鼠抓力、骨骼肌重量及肌纤维类型mRNA 表达变化

图7A 表明,在TG 鼠中,雌鼠抓力相对最大值(2.40 ± 0.11),相对平均值(2.09 ± 0.07),明显高于雄鼠最大值(2.04 ± 0.08)和平均值(1.75 ±0.06)(P＜ 0.05 或P＜ 0.01);与WT 雄鼠抓力最大值(2.35 ± 0.10),平均值(2.04 ± 0.08)相比,TG雄鼠抓力最大值和平均值显著降低(P＜ 0.05 或P＜ 0.01)。 图7B 中显示,TG 雌鼠腓肠肌和股四头肌相对重量为(5.93 ± 0.08)和(7.93 ± 0.11),显著低于TG 雄鼠的(6.44 ± 0.08)和(8.41 ± 0.10)(P＜ 0.01),WT 鼠中雌鼠的腓肠肌和股四头肌相对重量为(5.40 ± 0.08)和(7.38 ± 0.10),显著低于WT 雄鼠的(5.72 ± 0.06)和(7.76 ± 0.09)(P＜0.01);TG 鼠与WT 鼠比,其雌、雄鼠腓肠肌、比目鱼肌、趾长伸肌、胫骨前肌和股四头肌的相对重量都明显增加(P＜ 0.05 或P＜ 0.01)。 图7C 和7D 显示,TG 鼠中,雌鼠和雄鼠骨骼肌MyhcI的mRNA 表达无明显变化,雌鼠MyhcIIa、MyhcIIb和MyhcIIx的mRNA 表达则明显多于雄鼠(P＜ 0.05),分别高0.54、0.38 和0.33 倍,WT 鼠中雌鼠MyhcIIa的mRNA 表达显著高于雄鼠0.41 倍(P＜ 0.01);TG鼠与WT 鼠比,其雄鼠MyhcIIa和MyhcIIb的mRNA表达显著降低32.35%和29.41%(P＜ 0.05 或P＜0.01),雌鼠MyhcIIamRNA 表达明显减少26.39%(P＜ 0.05)。

2.7 各组小鼠肌糖原含量和骨骼肌丙酮酸脱氢酶(Pdha1)mRNA 表达变化

由图8A 可看出, TG 雌鼠肌糖原含量为(0.0120 ± 0.0009) mg, TG 雄鼠为(0.0092 ±0.0002) mg,WT 雌鼠肌糖原含量为(0.0099 ±0.0005)mg,WT 雄鼠则为(0.0080 ± 0.0005)mg。在TG 鼠和WT 鼠中,雌鼠肌糖原含量均明显高于雄鼠(P＜ 0.05 或P＜ 0.01);TG 鼠与WT 鼠相比,其雌、雄鼠肌糖原含量均显著增多(P＜ 0.05)。 图8B 显示,TG 鼠中雌鼠骨骼肌Pdha1 mRNA 表达显著多于雄鼠0.57 倍(P＜ 0.05);TG 鼠与WT 鼠相比,雄鼠骨骼肌中Pdha1 mRNA 表达显著降低32.04%(P＜ 0.01)。

3 讨论

Chrono是近年来在哺乳动物中新发现的生物钟基因[18-19]。Chrono可影响小鼠昼夜节律周期[9]。研究表明,Chrono是BMAL1 的靶基因,Chrono编码的CHRONO 蛋白可以和内源性BMAL1 相结合,并能抑制BMAL1-CLOCK 对其生物钟靶基因的转录活性[10-11]。 因此,CHRONO 蛋白被认为是BMAL1 的转录抑制因子,CHRONO-BMAL1 通路也是调控生物节律的重要通路[20]。

3.1 骨骼肌Chrono 过表达对小鼠自主活动节律性的影响

本研究对该鼠不同组织器官进行ChronomRNA表达的检测,发现在心脏、肾和肝中ChronomRNA的表达与WT 鼠相比虽有所提高但倍数较小,而腓肠肌中ChronomRNA 的表达高于WT 鼠约50 ～100 倍,并表现出了较大的性别差异。 表明该鼠确实是骨骼肌特异性Chrono过表达鼠。

该研究对骨骼肌特异性Chrono-TG 鼠进行自主活动节律性测试,利用自主转轮笼系统连续记录小鼠的运动情况,发现在3 d 全黑时间里,TG 鼠总活动量显著低于WT 鼠,而在24 h 的昼夜周期中,7:00 ～ 19:00 为休息期,活动量较少,在19:00 ～7:00 为活跃期,TG 鼠活动量明显低于WT 鼠,TG鼠其雌、雄鼠总活动量和活跃期活动量并无明显差异。 表明骨骼肌Chrono过表达可显著降低小鼠的自主活动性,而这种影响并无性别差异。

3.2 骨骼肌Chrono 过表达对小鼠体重、摄食及体成分的影响

本研究观察了骨骼肌Chrono过表达对小鼠体重、摄食量和体成分的影响,发现在摄食量和体成分上,TG 鼠和WT 鼠无显著差异,而体重在饲养第4、5 周出现TG 雄鼠明显低于WT 雄鼠的现象,这可能与TG 雄鼠摄食量始终偏低有关,导致其体重增长速度低于WT 雄鼠,从而在饲养后期出现体重差异增加。 此外,两种鼠在5 周饲养期内体重和摄食量均出现明显的性别差异,即雌鼠体重明显低于雄鼠,摄食量总体上低于雄鼠,而体脂百分比和瘦体重百分比无性别差异。 以上表明,骨骼肌Chrono过表达对小鼠体重、摄食量和体成分影响不大。

3.3 骨骼肌Chrono 过表达对小鼠运动能力、抓力和肌纤维类型的影响

研究发现,核心生物钟基因Bmal1 的表达可影响机体的运动能力。Bmal1 基因敲除鼠与同窝对照鼠相比,白天进行耐力运动的时间明显增加,晚上则无变化[21]。 骨骼肌特异性Bmal1 基因敲除鼠与同窝对照鼠相比,跑台测试中的运动距离和运动时间都显著升高[22]。 然而也有研究表明,Bmal1 基因与运动能力关系不大。 骨骼肌特异性Bmal1 基因过表达小鼠在进行递增负荷运动能力测试时的运动表现及最大摄氧量与野生鼠并无差异[23]。

CHRONO 作为BMAL1 的转录抑制因子,其对运动能力的影响目前尚不明确,因此,本研究采用骨骼肌特异性Chrono过表达鼠和WT 鼠,进行跑台递增负荷至力竭的运动能力测试,TG 鼠运动至力竭的时间和距离均明显低于WT 鼠,TG 鼠递增负荷运动至力竭的运动能力无性别差异。 表明骨骼肌Chrono过表达可显著降低小鼠有氧运动能力。

生物钟基因Bmal1 还可影响骨骼肌重量及肌纤维类型。Bmal1 敲除会使小鼠肌肉力量下降,粗细肌丝的超微结构出现损坏,甚至出现严重的肌肉萎缩等[24-26]。 非诱导型和可诱导型骨骼肌特异性Bmal1 敲除小鼠,均表现出正常的骨骼肌形态及超微结构,同时肌肉重量略有增加,肌纤维横截面积也更大,但肌肉力量有所下降,快肌纤维比例减少[14,27]。

而Chrono基因是否也会对骨骼肌产生影响呢?目前尚不清楚。 因而本研究对小鼠骨骼肌相关指标进行检测,发现TG 鼠其雌、雄鼠的腓肠肌、比目鱼肌、趾长伸肌、胫骨前肌和股四头肌的相对重量都明显高于WT 鼠,骨骼肌相对重量也表现出性别差异,WT 雌鼠和TG 雌鼠的腓肠肌与股四头肌相对重量均显著低于各自雄鼠。 此外,对小鼠前肢的抓力测试显示,TG 雄鼠的抓力显著低于WT 雄鼠,两种雌鼠间无明显差异,而雌性TG 鼠抓力则显著大于雄性TG 鼠。 TG 雄鼠的骨骼肌相对重量较大,但其抓力却较小,其原因可能与骨骼肌纤维类型的改变有关,而持续较短时间的前肢抓力则更多与快肌纤维相关[28]。 本研究对小鼠腓肠肌纤维类型进行mRNA 表达检测发现,慢肌纤维即MyhcI型在TG 鼠和WT 鼠中并无较大变化,但快肌纤维即MyhcII型的差异却比较明显,TG 雄鼠的MyhcIIa和MyhcIIb型肌纤维表达显著低于WT 雄鼠,TG 雌鼠3 种II 型肌纤维的表达均高于TG 雄鼠,这可能是造成TG 雄鼠抓力比WT 雄鼠和TG 雌鼠均较差的原因。

3.4 骨骼肌Chrono 过表达对小鼠糖耐量、肌糖原和骨骼肌丙酮酸脱氢酶(Pdha1)mRNA 表达的影响

核心生物钟基因Bmal1 被证实可显著影响骨骼肌糖代谢功能。 细胞实验表明,沉默Bmal1 基因会减弱C2C12 细胞的胰岛素信号通路作用,产生明显的胰岛素抵抗[12]。 动物实验表明,骨骼肌Bmal1特异性敲除可显著下调糖代谢相关基因mRNA 表达,使骨骼肌糖酵解作用减弱,葡萄糖吸收利用减少和糖耐量水平下降[13-14,16]。 而骨骼肌Bmal1 过表达会降低急性睡眠剥夺后小鼠骨骼肌的胰岛素敏感性[29]。

本研究发现,CHRONO 作为BMAL1 的转录抑制因子,与BMAL1 相同也会对小鼠糖耐量水平产生显著影响。 TG 鼠糖耐量血糖值及曲线下面积都明显高于WT 鼠,并且在WT 鼠和TG 鼠中都呈现出非常明显的性别差异,即雌鼠的糖耐量血糖值和曲线下面积显著低于雄鼠,而在血浆胰岛素和非禁食血糖方面,TG 鼠与WT 鼠相比并无异常。 同时TG雌、雄鼠肌糖原含量均明显高于WT 鼠,出现肌糖原大量积累的情况,而TG 雄鼠丙酮酸脱氢酶Pdha1 mRNA 的表达显著低于WT 雄鼠,丙酮酸脱氢酶是糖酵解进入三羧酸循环的关键[30],其表达减少提示糖有氧氧化过程受到抑制。 另外,两种雌鼠的肌糖原均明显高于各自相应雄鼠,Pdha1 mRNA 的表达也高于雄鼠或有升高的趋势,这可能是造成小鼠糖耐量出现性别差异的原因之一。 以上结果表明,骨骼肌Chrono过表达可导致小鼠肌糖原堆积,骨骼肌Pdha1 mRNA 表达减少,糖耐量异常。

骨骼肌Chrono过表达可降低小鼠自主活动性,导致糖耐量降低,并影响有氧运动能力。

参 考 文 献(References)

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