表面活性剂对鞣花酸的增溶及其抗氧化性能研究

伍佑辉，蒋新元，倪丹，贺靖雁，唐玉莲，庞亚辉，段泉

(1.中南林业科技大学 理学院，湖南 长沙 410004；2.中南林业科技大学 材料科学与工程学院，湖南 长沙 410004；3.湖南省木本生物质转化工程技术研究中心，湖南 长沙 410004)

鞣花酸是一种植物多酚，几乎不溶于水及醇类溶剂，而溶于吡啶、二甲基亚砜和三乙醇胺等[1-2]。既能抗炎、抗菌、抗病毒，又可以抗氧化、美白、抗衰老[3-4]，在化妆品中有很好的应用前景。它已列入《国际化妆品原料标准目录》(INCI)，也被列入国家食品药品监督管理局发布的《国际化妆品原料标准中文名称目录》中[5]。研究[6]表明化妆品里所添加的鞣花酸含量极低，很难达到标注所说的美白功能及抗衰老能力。

本实验研究了非离子型表面活性剂对鞣花酸的增溶作用，及鞣花酸在表面活性剂增溶体系中对自由基的清除能力，为扩大鞣花酸在化妆品[7]、医药等领域的应用提供基础支持。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

鞣花酸(w=98%)、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、DPPH、ABTS均为分析纯；维生素C(简称Vc)。

TM-1810型紫外可见分光光度计；85-2A数显恒温磁力搅拌器；BHS-1数显恒温水浴锅；1510酶标仪；96孔板。

1.2 实验方法

1.2.1 鞣花酸在非离子表面活性剂溶液中的紫外光谱测定 在150 mL锥形瓶中分别加入30 mg的鞣花酸，再分别加入0.10 g/L的非离子表面活性剂Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80溶液各100 mL，置于磁力搅拌器上以500 r/min搅拌3 h，然后在35 ℃的恒温水浴锅中密封静置24 h后定容摇匀，制备鞣花酸表面活性剂增溶体系。以相同浓度表面活性剂溶液作为参比，将制备鞣花酸表面活性剂增溶体系稀释10倍后用紫外分光光度计测定其紫外吸收光谱。

1.2.2 表面活性剂溶液浓度对鞣花酸增溶的影响 选取增溶效果好的表面活性剂进行浓度对鞣花酸增溶的影响研究。在150 mL锥形瓶中各加入30 mg 的鞣花酸，再加入一定体积配制好的表面活性剂标准溶液，分别配制表面活性剂溶液浓度在0.001～50.00 g/L范围的鞣花酸-表面活性剂增溶体系，然后置于磁力搅拌器上以500 r/min搅拌3 h，再在35 ℃ 的恒温条件下密封静置24 h后定容摇匀。以相应浓度表面活性剂溶液作为参比，鞣花酸表面活性剂增溶体系稀释10倍后在397 nm波长下用紫外分光光度计测定其吸光度，重复3次，取平均值。根据鞣花酸表面活性剂增溶体系标准曲线，计算鞣花酸在表面活性剂溶液中的增溶浓度。

1.2.3 温度对表面活性剂增溶鞣花酸的影响 选取浓度为10.00 g/L的表面活性剂溶液研究温度对表面活性剂增溶鞣花酸的影响，其余操作方法同上，选择温度范围5～45 ℃进行实验研究，重复3次，取平均值。

1.2.4 鞣花酸表面活性剂增溶体系稳定性的测定 在10.00 g/L的表面活性剂溶液中加入30 mg的鞣花酸，制备鞣花酸增溶体系，操作方法同上，在35 ℃ 恒温条件下存放，测定增溶体系中鞣花酸吸光度随时间的变化，重复3次，取平均值。

1.2.5 鞣花酸表面活性剂增溶体系对ABTS·清除能力的测定 按照文献[8]的方法，加以改进。ABTS溶液按照文献[9]配制：精密称取0.038 4 g的ABTS溶解于10 mL蒸馏水中，精密称取0.006 7 g的过硫酸钾溶解于10 mL蒸馏水中，避光冷藏放置16～24 h，得到ABTS母液。实验时用蒸馏水稀释，使其吸光度(λ=734 nm)在(0.7±0.1) 。

鞣花酸增溶体系的配制：以10.00 g/L的Tween-20溶液配制鞣花酸浓度为50 mg/L的Tween-20增溶体系。然后用相同浓度的Tween-20溶液为稀释液，配制鞣花酸浓度在0.10～8.00 mg/L范围的系列鞣花酸Tween-20增溶体系。

对照品Vc溶液的配制：配制浓度在0.10～8.00 mg/L范围的系列Vc溶液，配制好的溶液需避光保存。

ABTS·清除率的测定：在96孔板中按照文献[10]取液，混合液在室温避光反应30 min后，用酶标仪在734 nm下测吸光度值，计算抑制率。每个样品设置3个重复孔重复3次，取平均值。

ABTS·清除率(S,%)计算公式如下：

S=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(1)

式中A0——空白组(ABTS溶液+溶剂)的吸光度值；A1——样品组(ABTS溶液+样品)的吸光度值；A2——对照组(水+样品)的吸光值。

1.2.6 鞣花酸表面活性剂增溶体系对DPPH·清除能力的测定 按照文献[8]的方法，加以改进。DPPH溶液按照文献[9]配制：称取5 mg DPPH(精准至0.000 1 g)溶解于100 mL无水乙醇中，作为储备液。实验时用无水乙醇稀释，使其吸光度(λ=517 nm)在(0.7±0.1)。

鞣花酸增溶体系的配制：同1.2.5节,稀释配制鞣花酸浓度在0.20～10.00 mg/L范围的系列鞣花酸Tween-20增溶体系。

对照品Vc溶液的配制：配制浓度在0.20～10.00 mg/L范围的Vc溶液，配制好的溶液需避光保存。

DPPH·清除率的测定：在96孔板中按文献[10]取液，混合液在室温避光反应30 min后，用酶标仪在517 nm下测吸光度值，计算抑制率。每个样品设置3个重复孔重复3次，取平均值。

DPPH·清除率(S，%)计算公式如下：

S=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(2)

式中A0——空白组(DPPH溶液+水)的吸光度值；A1——样品组(DPPH溶液+样品)的吸光度值；A2——对照组(无水乙醇+样品)的吸光值。

1.2.7 粒径分布及Zeta电位测定 在室温下，将鞣花酸Tween-20增溶体系溶液注入测试项目对应的比色容器中，在90°散射条件下对鞣花酸Tween-20增溶体系溶液的粒径及电位进行测试，重复3次取平均值。

1.2.8 透射电镜(TEM)分析 用滴管取少量鞣花酸Tween-20增溶体系溶液滴加置200目铜网上，待滴加样品的铜网自然风干后，在50 ℃烘箱中干燥20 min除去多余的水分，然后置于TEM下寻找并分析鞣花酸Tween-20增溶体系溶液中的自聚体形态。

2 结果与讨论

2.1 非离子表面活性剂对鞣花酸的增溶效果

2.1.1 鞣花酸表面活性剂增溶体系中的紫外吸收光谱特征 非离子表面活性剂吐温(Tween)系列溶液中鞣花酸的紫外吸收光谱见图1。

图1 Tween系列溶液中鞣花酸的紫外吸收光谱Fig.1 UV absorption spectra of ellagic acid in Tween series solutions

由图1可知，Tween系列溶液中鞣花酸在255 nm 处均有一个强吸收峰，在397 nm处有一个弱吸收峰，与鞣花酸在水溶液中的紫外吸收光谱保持一致[1]，说明鞣花酸在Tween系列溶液进行增溶后结构没有发生改变，鞣花酸在Tween系列溶液保持了鞣花酸原有的性质和功效性。其中Tween-60的增溶效果明显较低，而Tween-20、Tween-40、Tween-80溶液对鞣花酸的增溶效果相差不大，其中又以Tween-20的增溶效果最好。

2.1.2 鞣花酸在Tween-20溶液中标准曲线的测定 精确称取12.5 mg鞣花酸，用10.00 g/L的Tween-20溶液进行溶解、搅拌、再使用超声处理使其完全分散溶解后定容于250 mL容量瓶中，分别稀释制备成鞣花酸浓度为1～25 mg/L系列鞣花酸Tween-20增溶体系，以相应浓度的Tween-20溶液为参比，于397 nm处测定鞣花酸的吸光度，以增溶体系的吸光度(A)对鞣花酸浓度(C,mg/L)作线性回归，得标准曲线方程：A=0.045 65C-0.050 16(r=0.999 4)，见图2，表明在1～25 mg/L内，增溶体系中鞣花酸的吸光度与鞣花酸的质量浓度呈良好的线性关系。

图2 鞣花酸Tween-20增溶体系的标准曲线Fig.2 Standard curve of ellagic acid Tween-20 solubilizing system

2.1.3 Tween-20溶液浓度对鞣花酸增溶效果的影响 不同浓度的Tween-20溶液对鞣花酸的增溶效果见图3。

图3 Tween-20溶液浓度对鞣花酸的增溶效果的影响Fig.3 Solubilization effect of Tween-20 solution concentrations on ellagic acid

由图3可知，当Tween-20溶液浓度较低时，鞣花酸的增溶随着Tween-20溶液浓度的增加而显著增加，当Tween-20溶液浓度达到1.00 g/L的时候，鞣花酸的增溶增长则变得比较缓慢，当Tween-20溶液浓度达到10.00 g/L以上的时候，鞣花酸的增溶不再随着Tween-20溶液浓度的增加而增加，甚至出现下降的趋势，可能是由于Tween-20溶液浓度较高时，溶液粘度较大，同时Tween-20分子间更易形成氢键，从而影响了鞣花酸分子在Tween-20分子聚氧乙烯链上的增溶。10.00 g/L的Tween-20溶液中鞣花酸的浓度为238.59 mg/L，相应温度下鞣花酸饱和水溶液的浓度为10.12 mg/L，约为水中溶解的鞣花酸质量浓度的24倍，因此，选取10.00 g/L的Tween-20溶液作为鞣花酸的增溶液来进行后续实验。

2.1.4 温度对Tween-20溶液增溶鞣花酸的影响 不同温度下， Tween-20溶液对鞣花酸的增溶情况见图4。

图4 温度对鞣花酸在Tween-20溶液中增溶的影响Fig.4 Effect of temperature on solubilization of ellagic acid in Tween-20 solution

由图4可知，在温度较低时随温度升高，鞣花酸在Tween-20溶液增溶效果逐渐提高，但增长不显著，当温度升高到35 ℃后，鞣花酸的增溶量变化趋缓，说明温度变化对鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶效果影响不大。在本论文实验中选择35 ℃进行实验。

2.1.5 鞣花酸Tween-20增溶体系的稳定性 由图5可知，鞣花酸Tween-20增溶体系在前8 d的吸光度数据较稳定，但从第8 d开始，吸光度出现骤降，第12 d以后，吸光度开始成规律性缓慢下降。综上，鞣花酸Tween-20增溶体系在开始配制好的一段时间内有较好的稳定性，但随时间延长，稳定性有所下降。

图5 鞣花酸Tween-20增溶体系稳定性随时间的变化Fig.5 Stability of ellagic acid Tween-20 solubilized system with time

2.2 鞣花酸Tween-20增溶体系的抗氧化作用

目前，常用DPPH·、ABTS·、超氧阴离子自由基、羟基自由基等清除实验及脂质过氧化抑制实验和总抗氧化能力的测定等方法来测定抗氧化性物质的体外活性[11]。由于在超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除实验中要用到FeSO4，而FeSO4易与鞣花酸生成蓝色络合物，从而影响测定结果，故实验室常用DPPH·清除[9]、ABTS·清除[10]分析鞣花酸的抗氧化作用[12-13]，本实验使用酶标仪-微孔板法测定鞣花酸Tween-20增溶体系对DPPH·、ABTS·的清除能力，并以Vc水溶液为对比。

2.2.1 鞣花酸Tween-20增溶体系对ABTS·清除作用 由图6可知，随着溶液浓度的增加，鞣花酸Tween-20增溶体系和Vc水溶液均对ABTS·的清除率增加，在浓度较低的情况下，鞣花酸Tween-20增溶体系对ABTS·的清除率明显大于Vc水溶液对ABTS·的清除率，鞣花酸Tween-20增溶体系对ABTS·的清除能力的IC50为0.31 mg/L，Vc水溶液的IC50为3.32 mg/L，说明鞣花酸作为一种很好的抗氧化活性成分经过表面活性剂增溶后其对ABTS·的清除能力不会受到影响，且增溶体系对ABTS·的清除能力优于Vc。

图6 鞣花酸Tween-20增溶体系对ABTS·的清除作用Fig.6 Scavenging effect of ellagic acid- Tween-20 solubilizing system on ABTS free radical

2.2.2 鞣花酸Tween-20增溶体系对DPPH·的清除作用 由图7可知，随着鞣花酸和Vc浓度的增加，鞣花酸Tween-20增溶体系和Vc水溶液均对DPPH·的清除率增加，在浓度较低的情况下，鞣花酸Tween-20增溶体系对DPPH·的清除率明显大于Vc水溶液对DPPH·的清除率，在浓度较高时，二者清除率相近，鞣花酸Tween-20增溶体系对DPPH·的清除能力的IC50为0.92 mg/L，Vc水溶液的IC50为2.40 mg/L。说明鞣花酸作为一种很好的抗氧化活性成分经过表面活性剂增溶后其对DPPH·的清除能力不会受到影响，且增溶体系清除DPPH·的能力优于Vc。

图7 鞣花酸Tween-20增溶体系对DPPH·的清除作用Fig.7 Scavenging effect of ellagic acid- Tween-20 solubilizing system on DPPH free radical

2.3 鞣花酸增溶体系的表征分析

2.3.1 粒径及Zeta电位分析 鞣花酸Tween-20增溶体系中粒子的大小及其分布指数(PDI)见图8。

图8 鞣花酸Tween-20增溶体系的粒径分布Fig.8 Particle size distribution of Tween-20 solubilized system

由图8可知，该增溶体系的平均粒径为(272.5±3.62) nm，PDI为0.230±0.010，Zeta-电位为(-41.57±1.88) mV，其粒径呈正态分布，但也存在微量粒径低于100 nm和高于3 000 nm以上的粒子，同时其电位的绝对值较大，说明增溶体系的稳定性较佳。

2.3.2 透射电镜形貌观察 通过粒径分析，对鞣花酸增溶体系的粒径大小有了大概的推论。为了更加直观的判断其微观结构，采用TEM对鞣花酸增溶体系中的形态做更为具体的展示，结果见图9。

由图9可知，鞣花酸增溶体系中不仅发现了直径约为40～100 nm(图9A)、100～1 000 nm(图9B)的聚集体，也有直径约为3 000～6 500 nm的大聚集体(图9C)，该现象与粒径分布测试的结果一致。

图9 鞣花酸Tween-20增溶体系透射电镜形貌观察图Fig.9 TEM morphology of ellagic acid Tween-20 solubilized system

3 结论

四种Tween系列非离子表面活性剂溶液对鞣花酸的增溶效果表明，4种Tween溶液对鞣花酸都有增溶作用，其中以Tween-20的增溶效果最好，Tween-60的增溶效果最差。

温度变化对鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶效果影响不大。在温度为35 ℃下，Tween-20溶液浓度低于1.00 g/L时，鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶量随Tween-20溶液浓度的增大而大幅提高，Tween-20溶液浓度介于1.00～10.00 g/L时，鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶量随Tween-20溶液浓度的增大而增长趋缓，当Tween-20溶液浓度超过10.00 g/L后，鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶量随Tween-20溶液浓度的增大反而逐渐下降。当Tween-20溶液浓度为10.00 g/L时，鞣花酸增溶浓度达到了238.59 mg/L，约为鞣花酸饱和水溶液浓度(10.12 mg/L)的24倍。

随着溶液浓度的增加，鞣花酸Tween-20增溶体系和Vc水溶液均对ABTS·和DPPH·的清除率增加，在浓度较低的情况下，鞣花酸Tween-20增溶体系对ABTS·和DPPH·的清除率明显大于Vc水溶液对ABTS·和DPPH·的清除率，鞣花酸Tween-20增溶体系对ABTS·的清除能力的IC50为0.31 mg/L，Vc水溶液的IC50为3.32 mg/L，鞣花酸Tween-20增溶体系对DPPH·的清除能力的IC50为0.92 mg/L，Vc水溶液的IC50为2.40 mg/L，说明鞣花酸经过表面活性剂增溶后其对ABTS·和DPPH· 的清除能力不会受到影响。

鞣花酸Tween-20增溶体系的平均粒径为(272.5±3.62) nm、Zeta-电位为(-41.57±1.88) mV，电位的绝对值较大，表明其稳定性较好。