壳聚糖-磷虾油纳米脂质体共轭物的制备及对斑马鱼胚胎生长发育的影响

郑炀凡, 陈艺煊，陈 娟，赵嘉雯，余慧琳，赵 燕，李泓浩，朱加进

（浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州 310058）

南极大磷虾（Euphausia superba）是南大洋生物圈里一种非常关键的物种[1-2]，目前是世界上生物资源量最大的单种生物之一[3]，其蛋白质含量高（16.31%），脂肪含量低（1.3%）且矿物质含量丰富，因此可以利用其开发活性蛋白肽、磷虾油、虾青素和甲壳素等高附加值海洋系列产品。其中，磷虾油因脂质组成比较特殊，以及诸多的功能而受到较高的关注[4]。磷虾油中含有磷脂以及脂肪酸这些脂类[5-6]【尤其富含二十碳五烯酸（C20 ∶5，EPA）和二十二碳六烯酸（C22∶6，DHA）这2 种n-3 多不饱和脂肪酸[7-9]】、虾青素、维生素、类黄酮和矿物质等。Miki 等[10]的研究表明，在抗氧化性能方面，虾青素的效果是β-胡萝卜素的10 倍，与α-生育酚对比更明显，高达100 倍。此外，磷虾油对改善非酒精性脂肪肝、心血管疾病[11]、三高[12-13]、结肠癌[14-16]、经前综合症[17]、代谢综合征、炎症[18-22]，提高学习及记忆能力，注意缺陷多动障碍和保护眼睛[23-24]等都有积极作用。然而，在水中的难溶性限制了磷虾油在食品中的应用，目前往往以胶囊的形式在市场上销售[25]。而DHA、EPA 和虾青素的高不饱和特性使它们在外界一些条件下易于发生降解，产生不好的感官影响，尤其是磷虾油中的虾青素，具有水溶性差、熔点高、化学不稳定性和低生物利用率的特点，因此强化其利用率具有重大意义。

壳聚糖（CS 或CHI）是一种高分子多糖，具有生物相容性、生物降解性、pH 敏感性、粘膜黏附性等有利特性，经常被用作一些药物的载体，以达到控制其释放，增强疗效和减少不良反应等作用。在生物医学和化学等领域的应用非常广泛[25]。与其它聚合物相比，壳聚糖分子的修饰因功能性氨基和羟基的丰富而相对容易实现。Ryu 等[26]制备了壳聚糖-邻苯二酚和其它相关的儿茶酚聚合物作为一种有前途的生物医学用黏合剂聚合物，其在pH=7 的水溶液中的溶解度从0 mg/mL 显著提高至近60 mg/mL。Mazloomi 等[27]在探究壳聚糖包被的橙种子蛋白水解物纳米脂质体的物理、化学性质时，发现用壳聚糖包被可以增加脂质体的稳定性，降低肽的释放速率，此外，包衣脂质体还有保护、控制释放和维持肽的抗氧化活性方面的功效。甚至还有研究果胶和壳聚糖共同偶联体，对新橙皮苷纳米脂质体在递送释放过程中的作用，其缓释效果优于壳聚糖单独偶联[28]。显然，基于壳聚糖的结合物已成为一类新的生物材料，在多学科领域的各种应用中具有广阔前景。

丙烯酰胺（Acrylamide，AA）是一种水溶性的有毒物质，被证明是动物物种中的神经和生殖毒物及致癌物。Lindeman 等[29]的研究表明AA 是一种已知的人类神经毒剂，可以通过胎盘转移和母乳到达发育中的胎儿。虽然在啮齿类动物出生前，暴露于AA 后已观察到不利的神经发育作用，但迄今为止尚未在人体中研究AA 对发育中的大脑的不利作用。斑马鱼作为一种脊椎动物模式生物在近20年被广泛应用于发育生物学、毒理学以及人类疾病模型构建等研究领域。其胚胎发育周期短、体积小、通体透明并易于观察等都是作为动物模型的优势。

本文首先对壳聚糖-磷虾油纳米脂质体的工艺条件进行响应面优化，针对优化后的产物，通过建立丙烯酰胺诱导的斑马鱼胚胎氧化应激模型，观察脂质体对斑马鱼胚胎生长发育的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物 雌雄斑马鱼，浙江大学医学院公共平台。

1.1.2 试剂 磷虾油 （约含磷脂52.64%、DHA 14.8%、EPA 22.5%、250 mg/kg 虾青素，其中30%～65%的脂肪酸是磷脂结合型，虾青素构成：20%游离虾青素、34%虾青素单酯、46%虾青素双酯），山东科芮尔生物技术公司；卵磷脂 （来自大豆，＞90%），上海麦克林生化科技有限公司；壳聚糖，北京华威锐科化工有限公司；胆固醇，上海达瑞精细化学品有限公司；无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司；pH=7.4 的磷酸盐缓冲液（由磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾配制而成），以上缓冲液配制试剂均来自阿拉丁生化科技有限公司；无水硫酸钠、甲醇、甲苯、石油醚、异丙醇、硫酸，国药集团化学试剂有限公司；正己烷【纯度≥99%，用于气相色谱（GC）检测】，上海麦克林生化科技有限公司；超滤离心管（30 ku），浙江同力信息科技有限公司；丙烯酰胺（AA），上海阿拉丁试剂公司；斑马鱼胚胎培养液 （0.05%海盐和0.002%亚甲基蓝）由纯净水、海盐与亚甲基蓝制备而成，浙江大学医学院公共平台。

1.2 仪器与设备

AL204 型电子天平 （0.1 mg），梅特勒-托利（Metter Toledo）公司；磁力搅拌器、超声细胞粉碎机，宁波新芝生物科技有限公司；BECKMAN 冷冻离心机，美国贝克曼公司；Zetasizer Nano ZS90 纳米粒度仪，英国Malven 公司；pH 计，瑞士mettlertoledo 托利多公司；7890A 型气相色谱仪（附氢火焰离子化检测器），美国Agilent 公司；Zetasizer Nano ZS90 纳米粒度仪，英国Malven 公司。

1.3 脂质体制备工艺

采用薄膜分散-超声法制备磷虾油纳米脂质体。称取一定质量的磷虾油、卵磷脂、胆固醇加入烧杯中，加入40 mL 无水乙醇，用磁力搅拌器涡旋混匀15～30 min，直至混合均匀，在旋转蒸发仪55℃恒温水浴中旋蒸至乙醇蒸发完毕，使烧瓶底部形成一层脂质膜。用一定量pH 7.4 的磷酸盐缓冲液水合，涡旋混匀30 min，再留30 min 静置，形成脂质体。然后用超声波细胞粉碎机在冰浴中超声8 min （超声功率为全超声功率的70%～80%），形成纳米脂质体。

把1%的壳聚糖溶液稀释成所需要的浓度后，将前面制备好的纳米脂质体以1∶6 的体积比滴加到稀释好的壳聚糖溶液中，涡旋混匀，静置30 min，使其充分结合，用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 调节pH 值至5.5，然后用超声细胞粉碎机超声2 min（60%超声功率）。

1.4 响应面优化脂质体制备工艺

运用Design Expert 设计BBD 试验。取卵磷脂与胆固醇质量之比（X1）、卵磷脂与磷虾油质量之比（X2）、壳聚糖质量分数（X3）为3 个因素，以脂质体粒径和包封率为响应值。通过前期的单因素实验已经确定了3 个因素比较适宜的比例分别为卵磷脂∶胆固醇=4∶1，卵磷脂∶磷虾油=20 ∶1，壳聚糖质量分数=0.1%，然后在单因素实验的基础上决定X1的3 个水平为3∶1，4∶1，5∶1，X2的3 个水平为18 ∶1，20 ∶1，22 ∶1，X3的3 个水平为0.1%，0.2%，0.3%，用（-1，0，1）编码，对应实际值如表1所示，BBD 试验设计及结果如表2所示。对结果进行方差分析后，再对数据进行二次回归拟合，采用式（1）二次多项式描述响应量同自变量关系的经验模型。

表1 BBD 试验设计因素水平及编码Table 1 Factor levels and coding of BBD experimental

表2 BBD 试验设计及其结果Table 2 Design and results of BBD experimental

式中，Y——预测响应值；β0——常数项；βi——一次项系数；βii和βij——二次项系数。

1.5 丙烯酰胺诱导的斑马鱼氧化应激模型建立

为了得到适宜斑马鱼胚胎生存的脂质体样品稀释倍数，将壳聚糖-磷虾油纳米脂质体共轭物溶液按照0 （不含样品），1 ∶100，1 ∶125，1 ∶150，1 ∶200，1∶250，1∶300，1∶350，1∶400，1∶450（与胚胎水的体积比） 比例稀释分组。当胚胎孵育时间到达7～9 hpf 时，将其随机分成10 组，每组60 个胚胎，转移到96 孔板中，1 孔1 个胚胎并加入适量胚胎水（250 μL），从24 hpf 开始每隔1 d 记录各组胚胎的存活率，来确定样品的最佳稀释倍数。把准备好的斑马鱼胚胎分为对照组（只加胚胎培养液）、丙烯酰胺组以及低、中、高3 个稀释倍数的脂质体处理组共5 组，每组设定3 个平行，每个平行50枚胚胎。

每组前期先经过一段时间暴露处理，其中空白对照组一直在胚胎培养液中培养，AA 组和实验组的胚胎在培养7～9 hpf 时，将培养液换成3 mmol/L 的丙烯酰胺溶液。干预1 h 后，丙烯酰胺组胚胎保持不变，实验组3 组的培养液都换成同时有3 mmol/L 丙烯酰胺溶液相应脂质体稀释倍数（0，1∶400，1∶350，1∶300） 的胚胎培养液中，直到24 hpf。将除对照组外4 组中的胚胎取出，漂洗2～3 次，然后把培养液换回胚胎水一直培养到72 hpf。

1.6 生长发育相关指标测定

从24 h 开始陆续观察自主运动、心率、畸形率、孵化率和第5 天体长等生长发育相关指标。

1.6.1 自主运动 自24 h 开始，每组取24 枚胚胎，在体式显微镜下观测各组胚胎在30 s 内自主运动的次数，每24 h 观察记录1 次，观察至72 h。

1.6.2 心率 自48 h 开始，每组取30 枚胚胎，在体式显微镜下观测胚胎15 s 内的心率 （心跳次数），然后在72 h 再观察1 次。

1.6.3 致畸率 自24 h 开始，观察和记录每组斑马鱼胚胎畸形情况，每24 h 记录1 次直到72 h，再对数据进行统计分析。

1.6.4 孵化率 自24 h 开始，观察和记录每组斑马鱼胚胎的孵化数量，每24 h 记录1 次直到72 h，再对数据进行统计分析。

1.6.5 第5 天体长 斑马鱼孵化至第5 天时，用合适浓度的麻醉剂将斑马鱼胚胎麻醉后在体式显微镜下观测体长并拍照，之后利用测量软件记录体长（mm）。不同浓度组和对照组还有丙烯酰胺组各测量18 条幼鱼的体长作为平行，取平均值作为每组第5 天的体长。

1.7 统计分析

用SPSS 软件对数据进行方差分析和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 响应面优化分析

2.1.1 以粒径为响应值的响应面优化结果 脂质体粒径系数显著性检验结果显示，该模型非常显著（P＜0.01）。失拟项（P=0.0722）不显著，表明模型与试验结果的拟合度比较好。相关系数R2=0.9913，说明试验结果中99.13%的实际值与模型中的预测值对应，关联度很高，校正系数RAdj2=0.9758，表明有2.42%的变异是不能用该模型去解释的。运用方差分析对模型方程的适用性进行评估，结果证明该模型拟合较好，预测脂质体粒径是适合的。C.V.（变异系数）=4.52%，该值越低表明试验的结果越可靠。

经过该模型的方程回归系数显著性检验，卵磷脂磷虾油比（X2）和壳聚糖质量分数（X3）对脂质体粒径的线性效应较显著（P＜0.01），而卵磷脂胆固醇比（X1）对脂质体粒径的线性效应不显著；卵磷脂胆固醇比（X1）、卵磷脂磷虾油比（X2）和壳聚糖质量分数（X3）的二次项的P 值都小于0.05，其中壳聚糖质量分数（X3）的二次项P 值小于0.01，说明对响应值的曲面效应较显著。制备过程表明，粒径与内部配方比例相关联，因此不同配比会在一定程度上影响粒径的大小。磷脂胆固醇比、磷脂磷虾油比和壳聚糖质量分数能够对粒径大小造成直接影响。壳聚糖质量分数（X3）的一次项回归系数（43.05）在3 个因素的一次项回归系数中最高，表明在试验范围内，壳聚糖质量分数（X3）对响应值的影响最大。

表3 壳聚糖-磷虾油纳米脂质体共轭物粒径响应面二次系数显著性分析Table 3 Response surface fitting quadratic coefficient significance test of the size of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate

表4 壳聚糖-磷虾油纳米脂质体共轭物粒径响应面二次模型方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic model of response surface experiment for the size of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate

单因素之间的交互作用也会对试验结果（脂质体粒径）产生影响，从结果可以看到X1X2、X1X3和X2X3都满足P＜0.05，且X1X2和X1X3的P＜0.01，表明三者之间两两交互对壳聚糖-磷虾油纳米脂质体共轭物粒径都有显著影响，且磷脂胆固醇比（PPL ∶CL）与磷脂磷虾油比（PPL ∶KO）、磷脂胆固醇比（PPL ∶CL）与壳聚糖质量分数（CH%）的交互作用对脂质体粒径相对来说影响更加显著。如图1a，在一定范围内，当PPL∶CL 和PPL∶KO 向最优点增加时，脂质体的粒径明显变小，而当PPL ∶CL和PPL∶KO 通过最优点后继续增加，脂质体粒径则明显变大，因素X1X3和X2X3的交互关系对粒径的影响同X1X2。

图1 交互作用对脂质体粒径影响的三维曲面图Fig.1 3D surface plots and contour plots of interaction effect on the size of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate

2.1.2 以包封率为响应值的响应面优化结果 脂质体包封率系数显著性检验结果显示，该模型P＜0.01，说明非常显著。失拟项不显著（P=0.9096），表明模型与试验结果的拟合度比较好。相关系数R2=0.9534，说明试验结果中95.34%的实际值与模型中的预测值一致，关联度很高，校正系数RAdj2=0.8694，表明13.06%的变异不能用该模型去解释。运用方差分析对方程适用性进行评估，结果证明该模型拟合较好，预测脂质体包封率是适合的。C.V.（变异系数）=0.47%，该值越低表明试验的结果越可靠性。

经过该模型的方程回归系数显著性检验，卵磷脂胆固醇比（X1）、卵磷脂磷虾油比（X2）和壳聚糖质量分数（X3）对脂质体包封率的线性效应都不显著；X12和X22皆P＜0.01，表明对响应结果的曲面效应很显著，而壳聚糖质量分数（X3）的二次项对响应值的曲面效应不显著。制备过程表明，包封率是与内部配方比例相关联的，因此不同的配比也会在一定程度上影响包封率的高低。磷脂胆固醇比、磷脂磷虾油比和壳聚糖质量分数能够对包封率的高低造成直接影响。壳聚糖质量分数（X3）的一次项回归系数（0.39）在3 个因素的一次项回归系数中最高，表明在试验范围内，壳聚糖质量分数（X3）对响应值的影响最大。

表5 壳聚糖-磷虾油纳米脂质体共轭物包封率响应面二次系数显著性分析Table 5 Response surface fitting quadratic coefficient significance test of the encapsulation efficiency of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate

单因素之间的交互作用也会对试验结果（包封率）产生影响，X2X3的结果说明卵磷脂磷虾油比和壳聚糖质量分数两两交互对壳聚糖-磷虾油纳米脂质体共轭物包封率有显著影响 （P＜0.01），而交互项X1X2和X1X3对响应值无显著影响。如图2a 所示，在试验条件范围内，当卵磷脂磷虾油比和壳聚糖质量分数向最优点增加时，脂质体包封率显著升高，而当卵磷脂磷虾油比和壳聚糖质量分数通过最优点后继续增加，脂质体包封率则显著降低。

图2 交互作用对脂质体包封率影响的三维曲面图Fig.2 3D surface plots and contour plots of interaction effect on the encapsulation efficiency of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate

表6 壳聚糖-磷虾油纳米脂质体共轭物包封率响应面二次模型方差分析Table 6 Analysis of variance of quadratic model of response surface experiment for the encapsulation efficiency of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate

2.1.3 响应面模型验证 通过软件分析，制备壳聚糖-磷虾油纳米脂质体的最佳工艺条件为：卵磷脂∶胆固醇=5 ∶1，卵磷脂∶磷虾油=19.6 ∶1，壳聚糖质量分数=0.146%，在此条件下粒径为145 nm，包封率为98.1%。为了验证优化工艺参数的可靠性，结合实际操作的方便性，将工艺参数调整为卵磷脂∶胆固醇=5∶1，卵磷脂∶磷虾油=20 ∶1，壳聚糖质量分数为0.15%的条件下进行3 次平行试验，得到脂质体粒径为146.3 nm，包封率为97.2%，与该模型的理论值误差小于2%，说明由响应面优化得到的最佳工艺条件具有高度的可靠性。

2.2 脂质体浓度对斑马鱼胚胎存活率影响

在前文方法中设计了10 组壳聚糖-磷虾油纳米脂质体共轭物浓度组，然而由于1∶100～1∶200间的浓度组120 h 后的存活率为0，因此未在表7中进行统计分析。

表7 不同稀释倍数壳聚糖-磷虾油纳米脂质体共轭物处理后斑马鱼胚胎存活百分比（%）Table 7 The survival rate of zebrafish embryos at after fertilization in different dilution ratio of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate （%）

由表7可知，当壳聚糖-磷虾油纳米脂质体共轭物稀释倍数在300～450 倍之间时，斑马鱼胚胎的存活率都比较高，而当稀释倍数为250 时，存活率与对照组相比显著下降（P＜0.01）。因此，最终选择稀释400 倍、350 倍、300 倍的壳聚糖-磷虾油纳米脂质体共轭物溶液进行下一步试验。

2.3 脂质体浓度对斑马鱼胚胎氧化应激模型生长发育的影响

2.3.1 斑马鱼胚胎自主运动 如图3所示，在胚胎发育过程中，单独暴露于3 mmol/L AA 组的斑马鱼胚胎自主运动明显受到抑制，而经过脂质体处理组对AA 组造成的自主运动抑制都有一定程度的改善，且呈剂量依赖性。其中高浓度组有显著的改善（24，48 h，P＜0.05，72 h，P＜0.01），斑马鱼胚胎从24 h 到72 h 的自主运动整体呈下降趋势，这可能是因为斑马鱼胚胎在不断孵化所致。

图3 脂质体对暴露在丙烯酰胺中斑马鱼胚胎自主运动情况的影响Fig.3 The effect of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate on autokinetic movement in zebrafish embryos exposed to AA

2.3.2 斑马鱼胚胎心率 如图4所示，在胚胎发育的过程中，单独暴露于3 mmol/L AA 组的斑马鱼胚胎心率明显受到抑制，而经过脂质体处理组对AA 组造成的心率降低都有显著的改善（P＜0.05或0.01 或0.001），且呈剂量依赖性。其中稀释350倍组和稀释300 倍组均有显著的改善（48 h，P＜0.001，72 h，P＜0.01），然而整体还是稀释300 倍的浓度组改善效果最好。

图4 脂质体对丙烯酰胺作用下斑马鱼胚胎心率的影响Fig.4 Effect of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate on heart rate in zebrafish embryos exposed to AA

2.3.3 斑马鱼胚胎畸形率 如图5所示，在胚胎发育过程中，将对照组作为参照，AA 组的单独作用对斑马鱼胚胎有显著性致畸作用 （P＜0.01 或0.001），斑马鱼胚胎生长发育过程中产生的畸形体现在心包水肿、充血和脊柱弯曲，然而一般不致死。观察记录斑马鱼胚胎的畸形情况累积至72 h，可以看到经过脂质体处理组对AA 组造成的畸形有明显的改善，且呈剂量依赖性。其中稀释300 倍组在72 h 时有显著的改善作用（P＜0.01）。

图5 脂质体对丙烯酰胺作用下斑马鱼胚胎畸形率的影响Fig.5 Effect of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate on malformation rate in zebrafish embryos exposed to AA

2.3.4 斑马鱼胚胎孵化率 如图6所示，在胚胎发育过程中，与对照组相比，AA 组的单独作用对斑马鱼胚胎的孵化有促进作用，这与Huang 等[30]的结果一致，而经过AA 和脂质体共同处理的组别对斑马鱼胚胎的孵化率有协同促进的效果，且都比AA 组孵化率高。到72 h 斑马鱼胚胎基本孵化完毕，因此组间无明显差别。

图6 脂质体对丙烯酰胺作用下斑马鱼胚胎孵化率的影响Fig.6 Effect of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate on hatching rate in zebrafish embryos exposed to AA

2.3.5 斑马鱼胚胎第5 天体长 如图7所示，在胚胎发育过程中，与对照组相比，AA 组的单独作用对斑马鱼胚胎的体长有显著的抑制作用（P＜0.001），而脂质体的处理有助于改善这种情况，且呈剂量依赖性，与AA 组相比，高浓度组（稀释300倍）对斑马鱼体长有显著的改善作用（P＜0.01）。

图7 脂质体对丙烯酰胺作用下斑马鱼胚胎第5 天体长的影响Fig.7 Effect of chitosan-krill oil nanoliposomes conjugate on body length （day 5） in zebrafish embryos exposed to AA

3 结论

经过响应面优化，在卵磷脂∶胆固醇为5∶1，卵磷脂∶磷虾油为19.6∶1，壳聚糖质量分数为0.146%条件下，制备的脂质体粒径适中，包封率较高，且经过验证也说明该模型的可靠性。由此条件制备的壳聚糖-磷虾油纳米脂质体共轭物，对由氧化应激损伤造成的生长发育受到抑制的斑马鱼模型，具有明显的改善作用，可改善氧化应激斑马鱼的自主运动、胎心率、体长，以及抑制畸形率等作用，且在一定范围内呈剂量依赖性。本研究为之后在食品中的应用提供了一定的参考。