儿童B(A)新亚型基因变异及家系分析*

任 倩，李春苗，刘兴莉

山东省济南市儿童医院输血科，山东济南 250022

ABO血型系统是输血医学中最重要的血型系统，输注ABO血型不相合的血液会引起急性溶血性输血反应、肾衰竭甚至死亡。因此，ABO血型的准确鉴定在临床输血、器官移植等方面起着重要作用。在婴幼儿血型鉴定过程中，由于其抗原、抗体的形成特点，给血型定型带来困难，此时常规血清学方法可能无法准确鉴定，需要应用基因测序的方法来确认。笔者对1例ABO血型定型困难的10个月婴儿进行了基因分型、家系及输血策略分析，意在加强输血科工作人员对婴幼儿ABO血型正确定型的重视,。

1 资料与方法

1.1一般资料 先证者，女，10个月23 d，因先天性室间隔缺损入院，输血前检查发现ABO血型正反定型不符且正定型A抗原反应弱，术前无输血史，同时采集其父母血液标本进行血型分析，家系成员均签署了知情同意书。

1.2方法

1.2.1血清学分型 抽取先证者及家长2～3 mL静脉血，EDTA抗凝，采用经典试管法进行ABO血型正反定型。所用试剂主要包括单克隆抗A、抗B(长春博迅生物技术有限责任公司)，抗A1、抗AB、抗H(瑞士Sanquin公司)，抗D IgM(上海血液生物医药有限责任公司)；反定型A1型、B型、O型红细胞(上海血液生物医药有限责任公司)。血型血清学分型方法和操作步骤参照《全国临床检验操作规程》。

1.2.2荧光定量聚合酶链反应(PCR)法基因分型 用人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒(荧光定量PCR法)(江苏中济万泰生物医药有限公司)进行基因分型。

1.2.3全血基因组提取及扩增 用全血DNA提取试剂盒(江苏中济万泰生物医药有限公司)提取基因组DNA。PCR扩增目的基因,产物经回收纯化用于序列测定,用江苏中济万泰生物医药有限公司测序试剂盒对ABO基因第1～5外显子和第6、7外显子进行序列测定。ABO基因参考序列为ABO*A1.01.1等位基因序列(GenBank：AJ536122)。

2 结 果

2.1血清学定型结果 血型血清学结果见表1。正定型，先证者与其母亲红细胞与抗A发生弱凝集(2+)，与抗B发生强凝集(4+)，与抗A,B发生强凝集(4+)，与抗H发生强凝集(3+)；反定型，先证者血清不与A1细胞凝集，其母亲血清与A1细胞发生弱凝集(±)；血清中无不规则抗体的存在。先证者父亲为正常的B型血反应格局。

表1 先证者及其家族成员的血清学结果

2.2血型基因分型 荧光定量PCR法检测结果显示,先证者及其母亲基因型为B/B，其父亲基因型为B/O02。

2.3基因测序结果及变异分析 先证者及其母亲基因型为B/B,测序结果显示其碱基序列同时存在ABO*B101和ABO*B(A)新的碱基特征。根据NCBI网站血型抗原基因突变数据库(以ABO*A1.01.1为参考序列)，发现其B(A)序列中，第6外显子c.297A>G突变，第7外显子的突变有c.526C>G、c.657C>T、c.803G>C、c.930G>A。ABO*B(A)新之所以为“新”，是其序列结果与已知的7种B(A)亚型序列相比，其c.796并未出现C>A变异；先证者的父亲基因分型为B/O02,测序结果显示其具有ABO*B101和ABO*O02的碱基特征。

2.4家系分析 根据ABO血型基因第1～7外显子测序结果显示，先证者与其母亲为B101/B(A)新，先证者父亲为B101/O02，未采集到先证者姐姐的血样。见图1。

注：罗马数字为世代顺序，箭头所指为先证者；“□”代表正常男性，“●”代表B101/B(A)新基因携带的女性。

2.5后续治疗 从输血的安全角度，给先证者选用了O型洗涤红细胞和AB型血浆用于临床手术及后期治疗，先证者痊愈出院。

3 讨 论

本研究中先证者为患有先天性室间隔缺损的新生儿，ABO血型正定型，A抗原 2+，B抗原 4+；反定型，血清与A1细胞、B细胞均不凝集，结果判定为正反定型不符。由于抗原、抗体生成的特点，在婴幼儿血型鉴定过程中，常常出现ABO血型正反定型不符的情况，排除标本及试剂质量、技术操作等原因外，还可能受疾病或亚型的影响。有研究显示，新生儿出生至18个月后ABO抗原才能充分发育，对于正定型抗原反应较弱的血型，笔者建议加做抗H、抗A1、抗AB等，必要时进行ABO血型基因鉴定[1-2]。

根据基因测序结果显示，先证者与其母亲为B101/B(A)新。B(A)亚型由YAMAMOTO等[3]发现，目前已被报道的B(A)等位基因有7种[4]，其中B(A) 02和B(A)04是我国最常见的基因型[5-6]。经与血型基因突变数据库比对,在已知的7种B(A)亚型中，均存在796C>A位点的基因突变，但在本研究的基因序列里，未发现有相同突变位点的B(A)亚型等位基因,表明先证者及其母亲均含有1条新的B(A)亚型等位基因。

B(A)亚型产生的分子机制可能是B等位基因在正常基因序列的基础上发生了单碱基的突变，这种突变如果发生在关键核苷酸位置上，能够引起单个氨基酸的变化，改变糖基转移酶的酶学特点和催化活性，使同一底物催化形成不同的产物[7]，从而使B等位基因具备编码双功能活性酶的能力，即B等位基因可以编码具有B糖基转移酶活性的B抗原，还可编码具有A糖基转移酶活性的A抗原。有研究证实，ABO*A101和ABO*B01两个等位基因在编码区仅有7个核苷酸的差异，其中c.297A>G、c.657C>T和c.930G>A位于密码子的摇摆位置，不引起氨基酸的改变；而c.526C>G、c.703 G>A、c.796 C>A和c.803G>C核苷酸的变异，会引起176、235、266和268位点4个氨基酸的替换[8-9]。其中p.176Arg、p.235Gly、p.266Leu、p.268Gly 4个氨基酸决定糖基转移酶A特异性，而p176Gly、p.235Ser、p.266Met、p.268Ala 4个氨基酸决定糖基转移酶B特异性。研究中，先证者在c.526C>G、c.657 C>T、c.803G>C、c.930 G>A位点发生了核苷酸的变异，其中，c.657 C>T和c.930G>A不引起氨基酸的改变；c.526C>G和c.803G>C核苷酸的变异其编码的氨基酸也随之改变，进而改变糖基转移酶的催化活性，使之具有编码A、B抗原双功能活性酶的功能。基于以上分子基础，B(A)亚型血清学主要特征为红细胞表面表达正常量的B抗原和少量A抗原，同时血清可能存在与A1细胞、A2细胞均反应的抗A抗体，因此在血型血清学鉴定时，易被判定为AB型。在血型鉴定过程中，应注意反应的凝集强度，对于凝集强度改变或者正反定型不一致的标本，需结合血清学和基因测序方法进行血型鉴定，以提高鉴定的准确率。

王静等[2]在4例ABO血型抗原弱化的患儿研究中发现，ABO血型基因调控区的启动子、增强子发生了变异，其中2例为先天性心脏病患儿，推测此类疾病可能会导致ABO血型抗原的弱表达。本研究通过家系分析发现，先证者B(A)亚型应来自于其母亲，与本身先天性室间隔缺损疾病可能没有关系。

一般而言，临床输血依据ABO血型相容性原则进行输注，这一原则可以解决绝大部分输血问题，但正确输血的基础是正确的血型鉴定。此病例中如果按常规原则，给B(A)亚型患儿输注AB型红细胞，会引起急性溶血反应，甚至可能危及患儿的生命，因此准确鉴定患儿的B(A)亚型，对于临床输血安全具有重要的意义，必须结合临床实际，选择适合的鉴定技术。